[发明专利]一种检测新型冠状病毒N基因的引物和探针及其试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种检测新型冠状病毒N基因的引物和探针及其试剂盒和方法。所述引物和探针包括新型冠状病毒特异性引物及探针、内参基因RPP30特异性引物及探针，所述新型冠状病毒特异性引物的序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8，探针的序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:9。所述试剂盒含有上述的引物和探针。所述检测方法使用了上述方案汇总的引物和探针或使用上述方案中所述的试剂盒。本发明经一步法荧光RT‑PCR机可快速、准确对EBVRNA模板进行核酸定量检测；可用于鼻/咽拭子/全血/血清样本中新冠病毒核酸定性检测，检测灵敏度高，特异性强，且操作简便、检测可靠性高。

技术领域

本发明属于技术领域，具体涉及一种检测新型冠状病毒N基因的引物和探针及其试剂盒和方法。

背景技术

2019新型冠状病毒(2019-nCoV)，2020年1月12日被世界卫生组织命名。 冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS) 和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人 体中发现的冠状病毒新毒株。

现已证实，该病毒属于β属冠状病毒，具有独特的刺突(spike)，其基因组 序列(RNA)与蝙蝠SARS样病毒(bat-SL-CoVZC45)具85％以上的同源性。世界 卫生组织已将该病毒(2019-nCoV)引发的疾病命名为：COVID-19(Corona Virus Disease 2019)。由于其传染性强及潜伏期长等特点，已成为严重威胁人们健康 的传染性疾病。

实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。而一步法实时荧光RT- PCR技术是实时荧光PCR的一种，它是一种直接快速检测RNA的方法，与检测 DNA的实时荧光PCR相比，具有节省反应时间、能够对检测样品进行准确定量分析、更加快捷和方便、假阳性率低、特异性高的优点。因此，该技术在RNA 样品的检测和分析中，已逐渐取代传统的RT-PCR方法，得到十分广泛的应用。

目前临床上针对2019-nCoV的核酸检测就采用的是一步法实时荧光RT-PCR 技术，然而，在使用已知的一步法实时荧光RT-PCR技术检测和定量分析样品中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，如何基于已知的靶多核苷酸序列设计、筛选及制备适当的引物和寡核苷酸探针成为了一个关键性的基本技术环节。

发明内容

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

使用核酸分析软件对已知的新型冠状病毒N基因的核苷酸序列进行同源性比较，通过严格的比对分析，在找出同源区段的基础上，进一步使用适当的引物设计软件选择并设计寡核苷酸引物和探针。具体四基于相应的N4基因、N5 基因或N6基因保守区设计的特异性引物和探针，由于所设计的引物和探针均具有互补于新型冠状病毒的序列，而且与其他病原体的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶的酶切位点，所以避免了新型冠状病毒检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度。

初步选择引物探针之后我们通过比对工具将引物探针分别进行进一步的序列比对，弃掉与基因组其它部分有可能形成错配的引物。

使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速蛋白质液相层析法纯化后进行氨解处理。同样合成所需的探针序列，氨解处理后分别在其 5’端标记作为荧光发生基团的FAM，并在其3’端标记借助活性连接臂偶联上作为荧光淬灭或抑制基团的TAMRA或BHQ-1。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后，使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20％)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。