[发明专利]尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP可视化检测方法及其试剂盒

说明书

本发明公开了尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP可视化检测引物组，包括引物FoM‑F3‑1和引物FoM‑B3‑1、引物FoM‑FIP‑1和引物FoM‑BIP‑1。据此，发明研制了相应试剂盒并建立了相应检测方法。应用本发明无需电泳和紫外观察等步骤，只需水浴锅或恒温箱反应60min，即可通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，灵敏度可达5.6pg/μL。本发明为解决尖孢镰刀菌苦瓜专化型早期的快速检测，提供了一种LAMP可视化检测方法，其灵敏度高、特异性好，能准确鉴定植株、种子等上的尖孢镰刀菌苦瓜专化型，而且高效、快速、便捷、低成本、易操作，适合基层快速诊断，对苦瓜枯萎病的早期诊断和有效防控的具有重要意义。

技术领域

本发明属于LAMP检测技术领域，尤其涉及一种尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP可视化检测方法及其试剂盒。

背景技术

尖孢镰刀菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.momordicae nov.f.)，属半知菌亚门真菌，是苦瓜枯萎病的病原菌。病菌以厚垣孢子或菌丝体在土壤、肥料中越冬，成为翌年主要初侵染源，病部产生的大、小分生孢子通过灌溉水或雨水飞溅，从植株地上部的伤口侵入，并进行再侵染。连作地或施用未充分腐熟的土杂肥，地势低洼、植株根系发育不良，天气湿闷发病重。由于常年连作，苦瓜枯萎病已成为苦瓜生产中主要病害，并有迅速蔓延的趋势。目前，对于苦瓜枯萎病尚未发现很好的特效药，主要以预防为主，在发病前或发病初期使用异菌脲、甲基硫菌灵、五氯硝基苯、多菌灵、恶霉灵、百菌清等化学药剂进行防治，发病中后期药剂对枯萎病基本无明显效果，导致严重的经济效益损失。因此，早期快速检测尖孢镰刀菌苦瓜专化型的方法尤为重要，可为苦瓜枯萎病的防治赢得宝贵时间。

环介导等温扩增技术(LAMP，Loop-mediated isothermal amplification)，是2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术。该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等病毒、细菌、寄生虫疾病的检测中，通过早期快速诊断对防止病症快速蔓延起到了积极作用。LAMP技术具有高特异性、高灵敏度的优点，而且操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，环介导等温扩增反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。

目前，尖孢镰刀菌的检测通常采用传统的形态特征鉴定方法、普通PCR检测法、real-time PCR检测法等。陈振东等公开了尖孢镰刀菌苦瓜专化型的RAPD标记和由该标记转化得到的SCAR标记以及这些分子标记在病原菌鉴别及发病组织检测中的应用；李欣等建立了尖孢镰刀菌的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法；刘迪秋等发明了一种三七根腐病致病菌尖孢镰刀菌的Real-time PCR检测引物及检测方法；车团结等发明了一种用于检测尖孢镰刀菌的核苷酸序列组；曹月霞尖建立了孢镰刀菌西瓜专化型分子检测技术。然而，这些检测方法均要使用昂贵的仪器设备，如PCR仪、荧光定量PCR仪等，而且其程序繁琐，不适于一些资源有限的实验室和生产上的基层工作者。

尖孢镰刀菌种内存在显著的遗传分化，如营养体亲和群(VCG)、生理小种或专化型。因此，利用LAMP技术鉴别不同专化型的尖孢镰刀菌时，需要寻找并发现不同专化型的特异性片段序列，并针对其设计特异性、灵敏度优良的特异性引物，才能实现准确识别和鉴定不同专化型尖孢镰刀菌，这对种内分离物之间的基因组序列同源性相当高的尖孢镰刀菌种而言要求非常高。因此，目前利用LAMP技术进行尖孢镰刀菌检测的研究报道很少，邓晟发明了基于Lamp技术对尖孢镰刀菌莲专化型病原菌的检测方法；杨雷亮等发明了一种同时检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号与4号小种的LAMP方法。然而，尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP检测技术尚未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强、准确性好且高效快捷、经济实用的尖孢镰刀菌苦瓜专化型LAMP可视化检测方法及其试剂盒。