[发明专利]一种葡萄果实早熟标志基因

权利要求书

1.一种葡萄果实早熟标志基因，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、选取对照组：选取自然生长6年的巨峰葡萄用含0.03％wet-77表面活性剂的水处理；

步骤二、试验组处理：在两组对照组葡萄上喷涂300mmol/L的H₂O₂，其中第一次喷施时间为开花后25天，第二次喷施时间为35天，开花后35天，每隔10天取样一次，直到处理后的果实成熟；

步骤三、葡萄小热激蛋白家族成员的鉴定：

(1)从数据库Ensembl Plants Database中下载葡萄基因组，然后获取HSP20保守结构域的隐马尔可夫模型，进行VvHSP20家族成员的确定，留下分子量在15–42kDa之间的成员，并将这些序列提交到CDD,Pfam和SMART进行结构域认证；

(2)葡萄的HSP20家族成员系统进化分析；

(3)基于RNA-Seq数据对葡萄HSP20基因家族成员进行表达分析；

(4)葡萄HSP20基因实时荧光定量分析；

(5)葡萄成熟相关基因VvHSP20全长cDNA分离；

(6)得出结论：确定VvHSP20家族有48个成员，结合系统发育分析和转录组数据分析，挑选出与葡萄成熟相关基因HSP20-39，在成熟过程中，在自然生长的巨峰葡萄和处理的巨峰葡萄，HSP20-39的表达存在显著差异。

2.根据权利要求1所述的一种葡萄果实早熟标志基因，其特征在于：在葡萄HSP20的家族成员系统进化分析中，将葡萄HSP20成员与已鉴定的拟南芥，番茄HSP20成员进行系统发育分析，通过MEGA7.0软件的邻接法对其进行系统发育树的构建。

3.根据权利要求1所述的一种葡萄果实早熟标志基因，其特征在于：利用qRT-PCR和RNA-Seq数据筛选出与葡萄成熟相关HSP20家族成员HSP20-39，基因ID为：VIT_16s0022g00510。

4.根据权利要求1所述的一种葡萄果实早熟标志基因，其特征在于：在葡萄HSP20基因实时荧光定量分析中，采用天根的试剂盒提取葡萄样品的总RNA，使用Takara的反转录试剂盒合成cDNA。

5.根据权利要求1所述的一种葡萄果实早熟标志基因，其特征在于：所述葡萄成熟相关基因VvHSP20全长cDNA分离包括：

提取葡萄样品的总RNA和测定提取RNA的浓度确定其质量、大肠杆菌转化和葡萄成熟相关基因的序列分析。

6.根据权利要求5所述的一种葡萄果实早熟标志基因，其特征在于：在提取葡萄样品的总RNA和测定提取RNA的浓度确定其质量后，使用Takara的反转录试剂盒合成cDNA，设计基因的正、反向引物：

VvHSP20 Forward：5'CCTTGCTCTCAGGTCACTTC 3'

VvHSP20 Reverse：5'CCTCTCCTCTTCCTTCAGCT 3'

以反转录模板cDNA进行PCR扩增，PCR反应体系：95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，34个循环；最后72℃延伸10min；扩增完成后PCR产物使用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，进行切胶并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收目的片段，最后进行TA克隆。