[发明专利]利用非抗生素筛选的游离型质粒载体制备iPSC的方法

权利要求书

1.一种诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，通过含有OriP/EBNA1非抗生素筛选和外源重编程因子的游离型质粒载体重编程血液细胞，即得到诱导多能干细胞；

所述含有OriP/EBNA1非抗生素筛选的游离型质粒载体包含R6K复制起始点和RNA-OUT蔗糖筛选标记，所述R6K基因序列如SEQ ID NO：1所示，所述RNA-OUT基因序列如SEQ ID NO：2所示；

所述外源重编程因子选自OCT4、NANOG、SOX2、LIN28A、KLF4、MYCL、MYCN、MYC、p53knockdown、MIR302/367cluster、ESRRB、REX1、GBX2、DLX4、ZSCAN10、ZSCAN4、TBX3、GLIS1、NR5A1/2、RARG、BMI1、KDM2B、TET1和SV40LT转录因子中的任意一种或者任意组合。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 从人类血液细胞中抽提单核细胞，通过扩增培养基进行选择性培养，获取红细胞祖细胞；

S2. 将非抗生素筛选的游离型质粒载体导入所述红细胞祖细胞中，得到含有非抗生素筛选的游离型质粒载体的红细胞祖细胞；

S3. 将所述含有非抗生素筛选的游离型质粒载体的红细胞祖细胞经多能干细胞诱导培养基培养，在无饲养层体系中诱导成重编程中间态细胞；

S4. 待完全诱导后，更换S3中所述的多能干细胞诱导培养基为多能干细胞培养基，对细胞维持培养，挑取形态类似于人胚胎干细胞的克隆进行扩增培养，接着对细胞进行鉴定，得到诱导多能干细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述扩增培养基配方为：每升扩增培养基包含ITS添加剂10ml、GlutaMAX 10ml、Lipid Concentrate1ml、L-抗坏血酸2-磷酸化半镁盐水合物 250µmol、硫酸亚铁3µmol、硝酸铁 0.2µmol、硫辛酸 1µmol、氢化可的松 1µmol、干细胞因子 100µg、促红细胞生成素 20µg、白细胞介素-3 5µg、剩余补充IMDM基础培养基。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述多能干细胞诱导培养基，其组分为在每升扩增培养基的基础上添加一种或多种以下小分子：CHIR99021 2.5-4 µmol、A-83-010.4-0.6 µmol和PD0325901 0.4-0.6 µmol。