[发明专利]一种系统性红斑狼疮的动物模型的构建方法

说明书

本发明公开了本发明属于疾病动物模型构建方法技术领域，具体涉及一种系统性红斑狼疮的动物模型的构建。本发明利用Crispr/Cas9技术，在小鼠谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)基因2号外显子上游及4号外显子下游插入loxP位点，构建亲代鼠1；亲代鼠2为包含中性粒细胞特异的Cre小鼠；将亲代鼠1和亲代鼠2进行杂交，获得所述杂合的GPX4基因和包含所述Cre基因的小鼠，该小鼠自发出现狼疮表型。本发明最终获得的小鼠，天然发病，3‑4月份开始出现表型，包括皮损，肾炎，自身抗体，低补体，高炎症因子，存在性别差异，雌性小鼠发病更重，更符合人类的发病特点。

技术领域

本发明属于疾病动物模型构建方法技术领域，具体涉及一种系统性红斑狼疮的动物模型的构建。

背景技术

系统性红斑狼疮(SLE)是一种系统性自身免疫疾病，其特征在于炎症因子风暴和自身抗体IgG的产生。中性粒细胞的数量减少是SLE的共同特征。SLE患者的转录组学显示中性粒细胞与肾炎的进展有关，此外，中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)与IFNα的产生，狼疮性肾炎，内皮功能障碍有关。然而，SLE患者的血液中性粒细胞数目减少的原因尚不清楚，中性粒细胞死亡方式和背后的分子机制仍然没有系统的阐释。

雌性SPF级MRL/lpr小鼠是目前国际上最为常用的SLE模型，1978年由Murphy等人建立。该鼠由LG/J，AKR/J，C3H、HeDi和C57BL/6J品系小数复杂交配产生，此类小鼠由于Fas基因缺陷，导致T细胞死亡率降低，自身反应性淋巴细胞不能通过凋亡途径清除，导致淋巴结肿大，脾大，并产生自身免疫病症状，特征是大量的anti-dsDNA，ANA抗体，和严重的肾小球肾炎。发病早，无性别差异。

NZB/NZW F1鼠是NZB老鼠和NZW老鼠交配后的第一代老鼠，自发出现狼疮表型，其亲代任一方均不发生病变。由Helyer在1963年发现。该模型小鼠4-5月开始发病，5-6月出现明显的肾小球肾炎的症状，10-12月进展为严重的狼疮，因肾衰竭而死。此类小鼠发病症状与人类相似，性激素对该鼠有明显的影响，雌鼠比雄鼠起病早且严重。特征是高滴度anti-dsDNA，anti-ssDNA抗体，高丙种球蛋白血症。

MRL/lpr鼠模拟的是T细胞凋亡缺陷导致的功能异常，以淋巴、脾脏肿大为特点，这两种器官含有大量淋巴细胞，因此，该模型主要模拟了适应性免疫系统异常。而先天免疫系统正常，例如：IFN-alpha不升高。尽管MRL/lpr鼠表现出anti-dsDNA抗体升高，蛋白尿，和低补体血症，但并不完全符合人类疾病的特点。例如狼疮主要以育龄期女性发病，男女比例为1:9，而MRL/lpr模型没有表现出性别差异。NZB/NZW F1小鼠，表现狼疮表型的原因不明，且发病周期长(6个月)，易受环境因素影响，且实验过程不易控制，为研究疾病的发病机制带来困难。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种新的狼疮模型：病因明确，同时能引起先天免疫和后天免疫系统(T、B淋巴细胞为主)异常，且实验周期短，为系统性红斑狼疮的发病机制的研究提供新的动物模型。

本发明提供一种新型系统性红斑狼疮的动物模型的构建方法，其包括如下步骤：

1)利用Crispr/Cas9技术，在小鼠谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)基因2号外显子上游及4号外显子下游插入loxP位点，构建亲代鼠1；

2)亲代鼠2为包含中性粒细胞特异的Cre小鼠；

3)将亲代鼠1和亲代鼠2进行杂交，获得所述杂合的GPX4基因和包含所述Cre基因的小鼠，该小鼠自发出现狼疮表型。

在本发明一个优选的实施方案中，所述构建方法还包括将获得的所述杂合的GPX4基因和包含所述Cre基因的小鼠再与亲代鼠2进行回交，筛选获得所述杂合的GPX4基因和包含所述Cre基因的小鼠，该小鼠自发出现狼疮表型。

其中，所述的包含中性粒细胞特异的Cre小鼠为Mrp8Cre小鼠或LysMcre小鼠。