[发明专利]一种检测RNA病毒核酸的高通量数字PCR试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种检测RNA病毒核酸的高通量数字PCR试剂盒，其特征在于，所述高通量数字PCR试剂盒包括高通量数字PCR检测试剂，所述高通量数字PCR检测试剂中含有用于检测RNA病毒核酸的引物和探针，所述用于检测RNA病毒核酸的引物和探针包括由SEQ ID NO:1所示的正向引物，由SEQ ID NO:2所示的反向引物，由SEQ ID NO:3所示的探针，由SEQ ID NO:4所示的正向引物，由SEQ ID NO:5所示的反向引物，由SEQ ID NO:6所示的探针，由SEQ ID NO:7所示的正向引物，由SEQ ID NO:8所示的反向引物，由SEQ ID NO:9所示的探针，由SEQ IDNO:10所示的探针，所述探针的一端标记有荧光基团，一端标记有猝灭基团。

2.根据权利要求1所述检测RNA病毒核酸的高通量数字PCR试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ，所述SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的5’端标记有HEX，3’端标记有BHQ。

3.根据权利要求1所述检测RNA病毒核酸的高通量数字PCR试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ，SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的5’端标记有HEX，3’端标记有BHQ。

4.根据权利要求1所述检测RNA病毒核酸的高通量数字PCR试剂盒，其特征在于，所述用于检测RNA病毒核酸的引物和探针还包括由SEQ ID NO:11所示的正向引物，由SEQ ID NO:12所示的反向引物，由SEQ ID NO:13所示的探针和SEQ ID NO:14所示的探针。

5.根据权利要求4所述检测RNA病毒核酸的高通量数字PCR试剂盒，其特征在于，所述SEQ ID NO:13所示核苷酸序列的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ，SEQ ID NO:14所示核苷酸序列的5’端标记有HEX，3’端标记有BHQ。

6.根据权利要求1所述检测RNA病毒核酸的高通量数字PCR试剂盒，其特征在于，所述高通量数字PCR检测试剂中还含有DNA聚合酶，三磷酸碱基脱氧核苷酸，PCR缓冲液，二硫苏糖醇，逆转录酶，逆转录缓冲液，RNA酶抑制蛋白和无RNA酶水。

7.一种利用权利要求1至权利要求6任一所述的高通量数字PCR试剂盒检测RNA病毒核酸方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、分别提取多个待测样本的RNA并进行混合，或者将多个待测样本混匀后再进行RNA提取，从而形成混合RNA模板；

S2、将高通量数字PCR检测试剂加入到预先混合的样本RNA模板并混匀，得高通量数字PCR反应混合液；

S3、将高通量数字PCR反应混合液制成大量的独立反应单元；

S4、进行逆转录及PCR扩增反应；

S5、对各反应单元的扩增结果进行读数和分析。

8.根据权利要求7所述高通量数字PCR试剂盒检测RNA病毒核酸方法，其特征在于，所述高通量数字PCR检测试剂中：DNA聚合酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸、PCR缓冲液、二硫苏糖醇、逆转录酶、逆转录缓冲液、RNA酶抑制蛋白、无RNA酶水、SEQ ID NO:1所示的正向引物、由SEQID NO:2所示的反向引物、由SEQ ID NO:3所示的探针、由SEQ ID NO:4所示的正向引物、由SEQ ID NO:5所示的反向引物、由SEQ ID NO:6所示的探针、由SEQ ID NO:7所示的正向引物、由SEQ ID NO:8所示的反向引物、由SEQ ID NO:9所示的探针和由SEQ ID NO:10所示的探针的体积比为2～6:20～50:30～60:5～20:5～20:15～35:0.5～1:3～5:3～18:3～18:3～5:3～18:3～18:3～5:3～18:3～18:2～5:2～5。