[发明专利]一种快速检测甜樱桃李属坏死环斑病毒的方法

权利要求书

1.一种快速检测甜樱桃李属坏死环斑病毒的试纸条，其特征在于由样品垫、涂覆纳米金-探针复合物的金标结合垫、设有检测线探针及质控线探针的硝酸纤维素膜、吸水垫和粘合底板组成，其中样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘于粘合底板上，各部分间应有2～3mm重叠，组装完成后压实，4℃下干燥储存，所述试纸条的制备工艺如下：

1)、DNA片段与探针的设计

通过在NCBI数据库中查找到的95条PNRSV病毒核酸序列，寻找高度特异保守区，确定检测序列，并以此为根据，设计出发夹DNA、纳米金Probe1、Probe2和Probe3。其中Probe1的5’端有巯基标记，可与纳米金结合；

2)、纳米金的制备

纳米金的制备采用氯金酸还原法制备，制备好的纳米金溶液4℃避光保存备用；

3)、纳米金-Probe 1复合物的合成

将上述1mL纳米金溶液浓缩后，将巯基修饰的Probe1通过Au-S键共价结合在纳米金表面,组装成纳米金-Probe1复合物，4℃避光保存；

4)、试纸条的组装

试纸条由样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和粘合底板五部分组装制备；

(1)样品垫由玻璃纤维组成，将样品垫在缓冲液中浸泡，37℃下干燥；

(2)金标结合垫由玻璃纤维组成，将上述步骤制备的纳米金-探针复合物滴加到玻璃纤维垫上，37℃下干燥；

(3)将硝酸纤维素膜在缓冲液中浸泡，37℃下干燥。在硝酸纤维素膜一端划上10μM的probe2溶液做为检测线，另一端划上10μM的Probe3溶液做为质控线，两条线之间的间隔为5mm，固定交联；

(4)吸收垫由吸水纸组成，在PBS缓冲液中浸泡，在37℃下干燥；

(5)将样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次粘在粘合底板上，各部分间应有2～3mm的重叠，组装完成后经重物过夜压实，4℃下干燥储存。

2.按照权利要求1所述的一种快速检测甜樱桃李属坏死环斑病毒的试纸条的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、样品的制备

取PNRSV阳性樱桃植株及无病毒组培苗叶片，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水清洗，采用CTAB法提取叶片总RNA，取1μg总RNA进行DNaseⅠ处理去除残余的DNA，95℃加热5min使酶失活后，冰上冷却，采用cDNA第1链合成试剂盒进行反转录获得cDNA；

2)、核酸外切酶Ⅲ酶切放大

取上述步骤制备的适量的cDNA，加入杂交Buffer，在95℃下加热5min，然后迅速置于冰水浴中，使之形成自由直链状态，将10μM Hairpin DNA溶液5μL加入10μL双蒸水中，95℃变性5min，然后慢慢冷却至室温，使其退火形成发夹型的二级结构，然后，将上述两种DNA溶液混合，加入ExoⅢ外切酶4μL，双蒸水补齐至50μL，37℃酶切60min，将反应后的溶液在80℃加热10min，使ExoⅢ外切酶失活，酶切反应终止，最后将酶切反应液冷却至室温，用于试纸条的检测；

3)、试纸条检测

将酶切反应液滴加在核酸检测试纸条的样品垫上，再加PBS缓冲液100μL作为展开液冲洗试纸条，最后根据检测线和质控线的显色情况进行结果判读：若检测线和质控线同时显示红色条带，则结果为阳性；若检测线不显色，质控线显示红色条带，则结果判定为阴性；若质控线不显色，则检测无效。