[发明专利]一种重组狂犬病病毒疫苗株及其制备方法

说明书

本发明公开一种重组狂犬病病毒疫苗株及其制备方法，属于动物疫苗技术领域。所述疫苗株以致弱疫苗SAD‑B19为母体毒株，将所述毒株的G蛋白上194位的天冬氨酸突变为丝氨酸，将333位的精氨酸突变为谷氨酸，在致弱疫苗SAD‑B19的基因组的G基因和L基因之间插入鼠源OX40L基因。本发明所述重组狂犬病病毒安全性高，具备作为疫苗株的安全低毒、长期有效的特点，可以作为狂犬病疫苗的候选株；与欧洲用于野生动物免疫的疫苗株即实验中的母本株LBNSE相比，所述重组狂犬病病毒能够迅速诱导产生显著高的中和抗体水平，并长达56天。

技术领域

本发明涉及一种重组狂犬病病毒疫苗株及其制备方法，属于动物疫苗技术领域。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染宿主中枢神经系统造成的一种烈性人畜共患传染病。宿主一旦发病，死亡率接近100％，目前尚无有效的治疗手段。近些年，我国平均每年约有3000人左右死于狂犬病，位居传染病死亡人数前三位，多数是由于被动物咬伤或者抓伤而被感染。数据显示，70％以上犬的免疫覆盖率可以有效控制人间狂犬病，因此，动物的免疫预防成为遏制人类狂犬病最为有效的措施。当前用于动物狂犬病免疫的疫苗主要为安全的灭活疫苗，但价格昂贵，并需多次免疫才能获得良好的保护，阻碍了其在我国的广泛应用。并且此类疫苗对于流浪动物及野生动物的免疫接种很难实现。而在我国，街头的流浪狗、猫等动物为当前狂犬病的主要传染源，将流浪动物进行有效的免疫是狂犬病防控的关键。因此，当前狂犬病毒研究的主要目标之一是发展低毒、可简化免疫程序及长期有效的狂犬病疫苗。

重组狂犬病病毒疫苗是一种利用反向遗传技术对狂犬病毒进行改造，有目的性地改变病毒的基因组结构，从而改变病毒的生物学特性，以增加安全性和免疫原性。欧美许多国家已经将重组狂犬病病毒疫苗应用于野生动物的狂犬病防控。1994年Schnell等第一次运用反向遗传技术成功的改造并拯救出狂犬病毒SAD B19株，目前应用的重组狂犬病病毒疫苗包括SAD B19株、RC-HL等。随后基于以这些病毒为母本，通过反向遗传学系统基础上构建了表达各种细胞因子，如GM-CSF、OX40L和Flt3L，缺失相关结构蛋白，如缺失M基因、P基因或G基因的重组病毒疫苗、过表达相关结构蛋白等重组病毒疫苗株。但这些疫苗均存在许多不足，其中很重要的不足有：①不能在早期就产生显著高水平的中和抗体；②中和抗体滴度不能维持长期有效的水平。例如，LBNSE-Flt3L在第21天时才能产生显著高水平的中和抗体滴度，至免疫后5周抗体水平与亲本毒株无差异。因此，发展低毒、单剂量及有效的狂犬病疫苗对狂犬病的控制具有重要意义。

OX40L是重要的协同刺激分子，参与机体免疫应答和多种疾病调控策略的重要环节。目前，国内外鲜有OX40L在疫苗诱导的免疫反应中调控滤泡内生发中心免疫途径的研究报道。通过细胞因子增强体液免疫反应对高效的狂犬病疫苗的研发具有重大意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株重组狂犬病病毒疫苗株，该病毒疫苗可以促进狂犬病毒免疫原性，诱导滤泡性T辅助细胞、生发中心B细胞和浆细胞的产生，增强机体的体液免疫反应。

本发明所述组狂犬病病毒疫苗株以之前报道的狂犬病疫苗株LBNSE为母本，将鼠源OX40L基因插入到LBNSE毒株基因组中，通过反向遗传操作技术拯救出能够表达鼠OX40L基因的重组狂犬病毒LBNSE-OX40L，该病毒株具有较高的病毒滴度，安全性高，并且在免疫后7天能迅速产生显著高水平的中和抗体，并维持机体体液免疫反应长达56天。

本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

本发明所述重组狂犬病病毒疫苗株，以致弱疫苗SAD-B19为母体毒株，将所述毒株的G蛋白上194位的天冬氨酸(AAT)突变为丝氨酸(TCC)，将333位的精氨酸(AGA)突变为谷氨酸(GAA)，在致弱疫苗SAD-B19的基因组的G基因和L基因之间插入核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的鼠源OX40L基因。