[发明专利]用于检测猫冠状病毒的RT-RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供用于检测猫冠状病毒的RT‑RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明针对猫冠状病毒Fcov MP基因序列，设计特异引物对、探针，经过反复试验建立了实时荧光RPA检测方法。本发明方法扩增特异性强，且敏感度高，可以在一次检测试验中将两种均可导致FIP的FCoV－Ⅰ型和FCoV－Ⅱ型两个血清型的病毒都检测出来，因此更高效。为Fcov快速诊断及防控提供了技术参考。

技术领域

本发明涉及一种用于检测猫冠状病毒的RT-RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法，属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

猫冠状病毒(Feline coronavirus，FCoV)为不分节段、单股正链RNA病毒，属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、α冠状病毒属(Alphacoronavirus)。FCoV有猫肠道冠状病毒(Feline enteric coronavirus，FECV)和猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis viruses，FIPV)两个生物型。虽然大部分感染FCoV的猫患轻微肠炎或无症状，但仍有12％的猫会发展成为猫传染性腹膜炎(FIP)，而FIP致死率高。基于病毒中和抗体反应和S基因氨基酸序列不同，FCoV分FCoV－Ⅰ型和FCoV－Ⅱ型两个血清型，两个血清型均可导致FIP。

现有检测FCoV的实验方法主要是PCR法，包括普通PCR和荧光定量PCR，还有间接免疫荧光法和ELISA方法。PCR技术由于检测灵敏度高，适用范围广，操作简便等原因应用广泛，但FCoV的PCR检测技术程序复杂、需要精密的仪器、检测时间较长，不利于非实验室环境下现场检测以及基层实验室的推广应用。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification RPA)是近年来发展起来的一种快速诊断不同病原的方法，已广泛用于病毒、细菌、寄生虫诊断中。RPA利用重组酶蛋白与引物形成复合物，该复合物促进引物与双链RNA的同源靶序列的结合，聚合酶进行后续的合成，整个过程仅需在37-42℃下反应20-30分钟即可。与普通PCR方法与荧光定量PCR方法相比，整个过程不需要高温变性和低温退火步骤，操作简单，不需要昂贵的仪器。

目前，国内外尚无采用实时荧光RPA检测Fcov的报道。因此，建立实时荧光RPA检测Fcov的方法十分必要。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种用于检测猫冠状病毒的RT-RPA引物对、探针、试剂盒及检测方法。本发明针对Fcov MP基因序列，设计特异引物对、探针，经过反复试验建立了实时荧光RPA检测方法。本发明方法快速准确，且可以同时检测冠状病毒的两个血清型，为Fcov快速诊断及防控提供了技术参考。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于检测猫冠状病毒的RT-RPA引物对，所述RT-RPA引物对上、下游引物序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示：

F:5′-GAAATCTATATGCTGAAGGTTTCAAAATGG-3′(SEQ ID No.1)；

R:5′-TAGTTGCTTTTAATTGTTTCCCAACTAATG-3′(SEQ ID No.2)。

本发明还提供一种用于检测猫冠状病毒的RT-RPA荧光探针，其序列如SEQ IDNo.13所示：

5′-TCTTACCATCGAGCATTTACCTAAATATGT_FNAT_QGATTGCTACACCT-3′(SEQ ID No.13)。