[发明专利]基于糖代谢标记获得O-GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA序列的方法

说明书

本发明公开了基于糖代谢标记获得O‑GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA序列的方法，包括利用叠氮标记的糖探针将细胞内所有O‑GlcNAc修饰转录因子标记上叠氮分子。通过甲醛交联，酶解超声获得叠氮标记的O‑GlcNAc修饰转录因子‑染色质片段。然后经过Click反应将生物素连接到叠氮标记的转录因子和染色质上，利用链霉亲和素磁珠与生物素亲和沉淀转录因子染色质复合物。最后解交联获得O‑GlcNAc修饰转录因子结合的染色质DNA。本发明首次开发了获得全基因组范围O‑GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA的方法，该方法特异性高、成本低，且制备得到的O‑GlcNAc糖转录因子结合的DNA样品可直接用于PCR检测或者扩增，构建DNA文库。

技术领域

本发明涉及糖生物化学染色质免疫共沉淀技术领域，具体而言，涉及一种获得全基因组范围O-GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA序列的方法。

背景技术

O-GlcNAc修饰是一种普遍存在于细胞质与细胞核中的蛋白质翻译后修饰，通过糖苷键连接于众多细胞内蛋白的丝氨酸、苏氨酸上。迄今已发现的O-GlcNAc 修饰的蛋白已超过4000种，主要包括转录因子、染色体结合蛋白、核孔蛋白、细胞骨架蛋白等。其中核内蛋白，特别是转录因子的O-GlcNAc修饰在基因转录和应激反应中发挥了重要的作用。已有研究表明很多转录因子都能发生 O-GlcNAc糖基化修饰，经糖基化修饰的转录因子可能影响转录因子的核定位，蛋白稳定性，转录调节活性等等。

对于O-GlcNAc转录因子的富集目前可以通过琥珀酰基化麦芽凝集素(sWGA)或者阱化学法。然而这些方法存在特异性不高，破坏糖链结构且操作繁琐的问题。目前，科学家们开发了一种代谢标记的方法，将具有特殊修饰基团(炔基、叠氮等)的单糖类似物导入到细胞中，这些外源的化学物质能够被细胞识别利用转化为糖供体底物类似物，从而使蛋白质或糖链标记上特殊修饰基团，进一步利用能够与这些标记基团发生化学反应的探针将目标糖基化蛋白富集出来。这是一种非常有效的富集O-GlcNAc蛋白的方法。

染色质免疫共沉淀技术使目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，对目的片断纯化与检测。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。ChIP-Seq的原理是:首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。

而近些年对O-GlcNAc修饰转录因子与DNA相互作用的研究一般是通过对已知的某一种转录因子或某几个转录因子分别使用抗体进行染色质免疫共沉淀，从而获得其结合的染色质DNA。目前已经发现了很多转录因子都能O-GlcNAc 修饰，但是还没有办法实现在全基因组范围一次性富集胞内所有O-GlcNAc修饰转录因子结合的DNA，也就意味着无法在组学层面上研究O-GlcNAc糖转录因子及结合靶基因DNA序列。

发明内容

本发明旨在基于O-GlcNAc糖代谢标记-染色质亲和沉淀获得全基因组范围 O-GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA序列的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。

基于糖代谢标记获得O-GlcNAc修饰转录因子结合染色质DNA序列的方法，包括步骤如下：

第一步，利用叠氮标记的糖探针将胞内O-GlcNAc修饰的转录因子代谢标记叠氮分子；

第二步，利用甲醛交联将叠氮标记的转录因子和染色质连接固定，然后将叠氮标记的转录因子-染色质裂解提取出来，通过酶解超声将染色质随机打断成小片段；