[发明专利]一种对神户肠杆菌种水平的快速检测方法

说明书

本发明涉及一种快速鉴定阴沟肠杆菌复合群特定种属的方法。本发明基于医院常见的神户肠杆菌（Enterobacter.kobei,Ek），利用NCBI数据库细菌基因组信息，找到该菌种核心基因组，从而靶定该菌种特有基因，建立了对阴沟肠杆菌复合群Ek鉴别的引物，利用PCR扩增目的片段的方法，为临床样本中神户肠杆菌的鉴定提供一条新颖、可靠的途径。利用本发明的特异性引物鉴定从临床样本中收集的ECC菌株，对其进行Ek菌种鉴别，具有灵敏度高、特异性强、准确性好、分类效率高等诸多优点。

技术领域

本发明涉及对阴沟肠杆菌复合群样品中神户肠杆菌的检测方法。

背景技术

阴沟肠杆菌复合群（Enterobacter cloacae complex ，ECC）是一类重要的医院致病性肠杆菌，能够引起65%-75%的感染，主要可引起伤口、尿道、下呼吸道、皮肤及软组织等的感染。其分布范围广，即使在陆地和水环境中，ECC也普遍存在。ECC主要包括阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae, EA)、霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei, EH)、神户肠杆菌(Enterobacter kobei, EK)、路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigi, ER)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae, EC)五大类，多位点序列分型在全球18个类群（Cluster（A-R））中已经鉴定出超过1069个序列（sequence type, ST）型。到目前为止ECC的分类地位还处在不断更新变化中，导致对阴沟肠杆菌的研究只能停留在复合群的水平，这妨碍了我们对其在物种层次上的临床意义、流行病学和耐药性特征的理解。

飞行质谱（MALDI-TOF）是一类使裂解的菌株在高离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器，在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，通过与大肠杆菌质控质谱图比对，参照数据库中样本质谱图，得到鉴定菌株菌种的鉴定方法。由于其鉴定速度快，鉴定效率高，通常被用在医院检验科鉴定菌种。但由于ECC各菌种之间亲缘关系相近，利用质谱仪鉴定ECC菌种，通常只能将ECC鉴定到复合群水平，无法确切区分ECC各菌种，这就导致医护人员对病人临床诊断、用药造成干扰。

由于质谱仪对ECC鉴定方法的不完善，科研人员目前通常采用ECC中的一个管家基因hsp60（引物序列对应SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4）对菌株进行PCR扩增、测序，鉴定ECC菌种。目前，hsp60基因分型是最广泛用于鉴别ECC种的方法。hsp60分型将ECC分为12个基因簇（I–XII）和一个不稳定序列簇（XIII），其中一些已经命名的遗传基因簇已重新分类到阴沟肠杆菌的其他种或者亚种。根据这种分型方法，神户肠杆菌被认为是临床和环境中的主要物种。但由于hsp60分型鉴定神户肠杆菌的方法耗时长、费用高、效率低，因此，在临床工作和科研实验中，急需一种快速准确直接鉴定到神户肠杆菌种水平的分类方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于鉴定神户肠杆菌种水平的多重聚合酶链式反应（PCR）方案。该方案包括：特异性引物、PCR反应体系，其主要特征在于根据神户肠杆菌特有基因设计一对特异性引物：

神户肠杆菌特有基因序列中所选取核酸序列

本发明所述的神户肠杆菌特有基因，搜索比对自NCBI数据库。

本发明所述的特异性引物序列对应SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2。

本发明所述的PCR扩增特异性片段方法，包括核酸提取、PCR扩增及电泳检测。