[发明专利]一种用于食管鳞癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用

说明书

本发明提供一种用于培养原代食管鳞癌上皮细胞的、含有MST1/2激酶抑制剂和ROCK激酶抑制剂组合的原代细胞培养基和使用了该原代细胞培养基的培养方法。所述培养方法中，使用上述原代细胞培养基在包被有细胞外基质胶的培养器皿上培养原代细胞，使得原代细胞快速增殖。由本发明的原代细胞培养基和原代细胞培养方法得到的细胞模型，能够用于药物的疗效评估和筛选。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体而言，涉及用于在体外培养或扩增原代食管鳞癌上皮细胞的培养基及培养方法，还涉及培养得到的细胞在药物的疗效评估和筛选中的方法和应用。

背景技术

食管癌是目前世界上最常见的胃肠道恶性肿瘤之一。根据国家癌症中心统计最新数据显示，男性发病前十位恶性肿瘤中食管癌占第六位，女性食管癌占第二位。世界上多个地区呈地方性发病率升高，而我国是属于食管癌高发地区，年发病人数是24.6万，年平均死亡人数约15万人，占全国肿瘤死亡率21.8％，在导致死亡最多的癌症中死亡率排名第4位(2019国家癌症中心数据)。近年来，尽管人们对食管癌的分子分型和发病机制的研究取得一些进展，但由于在国内外食管癌分子分型的差异性，导致针对食管鳞癌尤其是中晚期患者的治疗手段仍然有限，缺乏个性化的精准用药指导。因为食管鳞癌不同于腺癌有比较明确的分子靶点，所以仅凭分子或基因诊断很难真正预测临床用药的疗效。

功能性测试是指在体外对抗肿瘤药物在癌症患者细胞上的敏感性进行检测的方法。应用这一方法的关键在于开发生长周期短且能够代表食管鳞癌患者自身生物学特性的肿瘤细胞模型。另外，所述细胞模型应操作便捷能快速高效地预测临床用药的疗效，从而及时给予癌症患者精准用药指导。然而，取自癌症患者的原代肿瘤细胞在体外建立细胞模型成功率往往很低，生长周期长，并存在成纤维细胞等间质细胞过度增殖等问题，制约着这一领域的发展。目前有两种培养原代上皮细胞/干细胞的技术在肿瘤细胞功能性测试应用领域发展得相对成熟，一种是使用经辐射的饲养细胞和ROCK激酶抑制剂Y27632来促进原代上皮细胞的生长以考察个体患者的药物敏感性的技术，即细胞条件重编程技术(Liu等，Am JPathol，180：599-607，2012)。另一种技术是体外3D培养成体干细胞从而获得类似于组织器官的类器官技术(Hans Clevers等，Cell，11，172(1-2)：373-386，2018)。

然而，这两种技术都存在一定的局限性。细胞重编程技术是一种将患者自体原代上皮细胞与鼠源性饲养细胞共培养的技术。在对患者原代细胞进行药物敏感性测试时，这些鼠源性细胞的存在会干扰患者自体原代细胞的药物敏感性检测结果；但如果撤除鼠源性饲养细胞，病人自体原代细胞就脱离了重编程环境，细胞的增殖速率和细胞内信号通路会发生明显的改变(Liu等，Am J Pathol，183(6)：1862-1870，2013；Liu等，Cell Death Dis.，9(7)：750，2018)，从而使患者自体原代细胞对药物的响应结果受到较大影响。类器官技术是将患者自体原代上皮细胞包埋在细胞外基质内进行体外三维立体培养的技术，该技术无需饲养细胞，因此不存在鼠源性饲养细胞的干扰问题。但是类器官技术的培养基内需添加多种特定的生长因子(如Wnt蛋白和R-spondin家族蛋白)，成本昂贵，不适于普及到临床进行大规模应用。另外，类器官在整个培养过程中均需将细胞包埋在细胞外基质胶中，其细胞接种、传代和药物敏感性测试的铺板步骤相较于2D培养操作繁琐费时，且该技术所形成的类器官大小尺寸不好控制，易出现部分类器官生长过大而导致内部发生坏死的情况。因此，类器官技术相较于2D培养技术可操作性和适用性不强，需要专业技术人员操作，不适合大规模广泛应用于临床体外药物敏感性检测(Nick Barker，Nat Cell Biol，18(3)：246-54，2016)。

鉴于以上技术的局限性，临床上需要开发一种原代食管鳞癌上皮细胞培养技术，其培养周期短，成本可控，操作便捷，不受外源性细胞干扰。在将该技术应用于构建原代食管鳞癌肿瘤细胞模型时，所培养的食管鳞癌肿瘤细胞能代表食管鳞癌患者自身的生物学特性。通过体外评估抗肿瘤药物在不同癌症患者个体所衍生的细胞模型上的敏感性，来提高临床上抗肿瘤药物的响应率，减少不合适的药物给患者造成的痛苦及医疗资源的浪费。

发明内容