[发明专利]重组载体的构建方法及其构建的重组载体及应用

说明书

本发明涉及分子生物学和蛋白质技术领域，具体涉及重组载体的构建方法及其构建的重组载体及应用。本发明提供的构建方法操作简便，本发明提供的重组载体能够表达包括IgG抗体、Fab抗体、Fv抗体、人源化ScFv‑Fc抗体以及鼠/人嵌合抗体等各类不同功能的抗体，提高了抗体表达效率。

技术领域

本发明涉及分子生物学和蛋白质技术领域，具体涉及一种重组载体的构建方法及其构建的重组载体及应用。

背景技术

随着抗体工程的发展，建立在噬菌体外壳表达抗体片段的能力基础上的噬菌体展示技术产生，即从免疫后的脾细胞、外周血淋巴细胞等提取mRNA，逆转录成cDNA，利用PCR技术分别扩增出抗体的重链及轻链基因，按一定的方式将两者连接克隆到表达载体上，并在适当的宿主细胞中表达成有功能的抗体分子，从而利用抗原-抗体特异性结合进行筛选、扩增，再用亲和层析等手段纯化抗体片段。例如中国专利ZL 201610050665.2《进行抗体表达和组装的重组系统及应用》，专利申请日2016年1月26日，授权公告日2017年10月3日。该发明公开一种表达抗体重链和轻链的真核表达载体，其目的是提供一种重组真核表达载体及其构建方法，便于表达各类抗体。本发明还公开了pRTL1-HC和pRTL1-LC的上述真核表达载体的应用。本发明是以表达表达IgG抗体重链和轻链的真核表达载体为基础，进一步能够表达包括IgG抗体、Fab抗体、Fv抗体、人源化ScFv-Fc抗体以及鼠/人嵌合抗体等各类不同功能的抗体，有助于提高抗体表达Fv、Fab及ScFv等片段的表达效率，为能够成功表达各种不同功能的抗体起到关键性作用。但是双质粒系统存在转染前准备工作繁琐，转染时需要双倍剂量的转染试剂造成成本翻倍等问题。

因此，希望提供一种抗体表达效率高，操作简便的构建方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种重组载体的构建方法及其构建的重组载体及应用。本发明提供的构建方法操作简便，抗体表达效率高。现有技术方案的缺陷：

第一方面，本发明提供了一种重组载体的构建方法，所述构建方法包括下述步骤：

1)pRTL1-LC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段做A2798C突变来毁掉SpeⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL1-LC的对应位置制得pRTL2载体；

2)pRTL1-LC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段做A4132G和A4137C突变来毁掉SalⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL2的对应位置制得pRTL3载体；

3)pRTL3载体作为模板用于overlap PCR扩增目的片段做T620A和G626C突变来加入SpeⅠ位点的同时毁掉EcoRⅠ位点，同时在尾端加入BamHⅠ、ClaⅠ和XbaⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL3的对应位置制得pRTL4载体；

4)pRTL1-HC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段4685bp-1994bp部分，同时在尾端加入SalⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL4的对应位置制得所述重组载体-pRTL5载体；或者

4’)pRTL1-HC质粒作为模板用于overlap PCR扩增目的片段573bp-1994bp部分，同时在5’端加入BamHⅠ位点，3’尾端加入ClaⅠ位点，扩增产物通过双酶切后连接到pRTL4的对应位置制得所述重组载体-pRTL6载体；

其中，所述pRTL5载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述pRTL6载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，步骤1)中，所述双酶切的位点为pRTL1-LC上游1284bp处的NheⅠ酶切位点和和下游3029bp处的NdeⅠ酶切位点。