[发明专利]一种胎盘底蜕膜干细胞的分离方法

权利要求书

1.一种胎盘底蜕膜干细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)采集胎盘，并浸泡于胎盘保存液中；

(2)将步骤(1)所述的胎盘进行底蜕膜剥离，获得底蜕膜，用清洗液初步清洗底蜕膜，然后用一次性移液管吸取清洗液再次清洗，直至底蜕膜血液被清洗干净；

(3)用剪刀将步骤(2)处理后的底蜕膜剪碎，将剪碎后的底蜕膜用酶解液a进行酶解后离心，弃上清液，再用酶解液b进行酶解；底蜕膜剪碎后的面积为3×3cm²；在37℃，酶解液a与底蜕膜以10:1的体积比，200R酶解0.5h，1500rpm离心5min；在37℃，酶解液b与底蜕膜以20:1的体积比，200R酶解1.5-2.5h；所述酶解液a为含有质量浓度为0.25％胰酶和质量浓度为0.02％EDTA的DMEM高糖基础培养基；所述酶解液b为含有0.1-0.2mg/mL胶原酶Ⅳ、0.01-0.05mg/mL中性酶、5-10ng/ml Fas ligand抑制剂和5-10ng/ml survivin抑制剂的DMEM高糖基础培养基；

(4)将步骤(3)酶解后的组织液取出，分装至离心管中，并加入细胞清洗液，配平后离心；

(5)倒掉步骤(4)离心后的上清液，加入细胞清洗液重悬细胞沉淀，再用细胞筛网过滤到离心管中，混匀后取细胞悬液用细胞计数板计数，然后配平后离心；

(6)倒掉步骤(5)离心后的上清液，用培养基溶液调整细胞接种密度，添加双抗，混匀后接种。

2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤(1)的具体操作为将分娩后获得的胎盘在6小时内浸泡于保存液，所述保存的温度为4℃；所述胎盘保存液为PBS中含有1×-2×双抗、体积浓度为10％高糖DMEM的基础培养基。

3.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤(2)中，所述清洗液为0-4℃PBS，所述一次性移液管的体积为10mL。

4.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤(4)中，所述离心管中每管中的组织液不超过25mL，所述加入细胞清洗液的体积与所述组织液相同，所述离心的速率为2000rpm，所述离心的时间为5min。

5.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤(5)中，用移液管向每管加入10mL细胞清洗液重悬细胞沉淀，用100μm细胞筛网过滤到1支50mL离心管中，混匀后用移液枪头取50-200μL细胞悬液用细胞计数板计数；所述离心的速率为2000rpm，所述离心的时间为5min。

6.如权利要求1或5所述的分离方法，其特征在于，所述细胞计数板计数具体为按细胞悬液与0.4％台盼蓝以1:1的混匀后，取10μL滴至细胞计数板上计数，检测细胞活力并计算细胞总数。

7.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤(6)中，所述培养基为Lonza完全培养基，所述细胞接种密度为(1-1.5)×10⁵cell/mL，所述双抗为100×双抗。

8.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤(6)中，用10cm培养皿接种的步骤为用移液管接种10mL的细胞悬液至10cm培养皿中；用15cm培养皿接种的步骤为用移液管接种20mL的细胞悬液至15cm培养皿中；接种后十字摇晃培养皿5次，使细胞悬液均匀分布于培养皿中。