[发明专利]一种检测香豆素与茚满二酮类杀鼠剂的酶联免疫试剂盒及其制备和应用

说明书

本发明公开了一种检测香豆素与茚满二酮类杀鼠剂的酶联免疫试剂盒、试剂盒的制备以及应用，本发明所提供的试剂盒由酶标板、抗体工作液、酶标记物工作液、洗涤液、样品稀释液、样品提取液、含不同梯度浓度鼠得克标准品溶液、底物显色液、终止液组成。本发明所提供的鼠得克检测试剂盒可用于食品和人血清中香豆素与茚满二酮类杀鼠剂的检测，在猪肉、牛奶、血清中鼠得克、氯灭鼠灵、敌鼠检测限为5.0µg/kg、氯敌鼠检测限为2.5µg/kg、溴敌隆、大隆、华法林检测限为10.0µg/kg、氟鼠灵检测限为15.0µg/kg，批间变异系数小于10%、批内变异系数小于15%，具有操作简单、快速，灵敏度高、特异性强、准确性强的优点，对于食物中毒的快速检测具有重大价值。

技术领域

本发明属于药物残留快速检测领域，涉及一种检测香豆素与茚满二酮类杀鼠剂的试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

杀鼠剂种类繁多，抗凝血杀鼠剂是使用最广泛的一类杀鼠剂，包括香豆素类如鼠得克、氯灭鼠灵、氟鼠灵、杀鼠醚等，以及茚满二酮类如大隆、敌鼠、氯鼠敌等，它们通过竞争性地抑制维生素K的作用，抑制肝脏产生凝血酶原及凝血因子，提高毛细血管通透性和脆性，造成鼠内出血死亡。随着此类灭鼠剂的大量施用，鼠药不可避免地残留在食物中，影响人类健康。近年来，此类灭鼠剂造成中毒的事件时有发生，严重危害人民身体健康与生命安全。

目前检测上述抗凝血杀鼠剂的检测方法主要有高效液相法和液相色谱质联用法，这些方法特异性强、灵敏度高，但是操作繁琐、仪器昂贵，不适用于大批量样品的筛选检测。而快速检测方法主要是化学法比色检测方法，特异性、灵敏度差，易发生误判，不能满足现场检测需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种香豆素与茚满二酮类杀鼠剂酶联免疫检测试剂盒，并提供一种灵敏度高、特异性强、检测成本低、适于大批量样品筛选的检测方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种检测抗凝血杀鼠剂的酶联免疫试剂盒，由酶标板、标准品工作液、抗体工作液、酶标记物工作液、样品稀释液、样品提取液、洗涤液、底物显色液、终止液组成。

所述酶标板由鼠得克药物半抗原与载体蛋白的偶联物包被制成。

所述鼠得克半抗原具体制备方法如下：称取鼠得克100mg用10ml甲醇溶解，加入30mg氢化钠,36mg四溴丁酸室温反应，TLC检测反应完全后向体系中加入饱和食盐水50ml，经过滤、洗涤、干燥即得式I所述化合物。

所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA）、人血清白蛋白（HSA）、鼠血清蛋白（MSA）、甲状腺蛋白（BCG）、兔血清蛋白（RSA）、血蓝蛋白（KLH）或卵清白蛋白（OVA）。

所述鼠得克半抗原与载体蛋白的偶联物是指鼠得克半抗原与载体蛋白通过活性酯法得到的产物，具体包括如下步骤：

1）将所述鼠得克半抗原（式I）溶解于二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），20-25℃磁力搅拌反应2-3 h，得到溶液I；

其中，所述鼠得克半抗原（式I）、所述二甲基甲酰胺（DMF）、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、所述N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的配比为36.4 mg：1.5mL：38.3 mg：23mg；

2）将所述载体蛋白置于0.1 M碳酸氢钠缓冲液中，200 rpm搅拌10 min，充分溶解，得到溶液II；所述载体蛋白与所述0.1 M碳酸氢钠缓冲液的配比为50 mg：3.5 mL；

3）将所述溶液I和所述溶液II混合，具体为在0-4℃条件下，1000 rpm搅拌下，将溶液I逐滴加入到所述溶液II中，500 rpm搅拌反应24 h，得到溶液III；