[发明专利]以核酸为靶的核酸的组合物和方法

权利要求书

1.工程改造的以核酸为靶的单导向核酸，其能与II型CRISPR Cas9蛋白形成复合物，所述工程改造的以核酸为靶的单导向核酸包含：

间隔区序列，所述间隔区序列包含能与靶核酸序列杂交的序列；

双链体，所述双链体包含：

位于最小CRISPR重复序列和最小tracr序列之间的杂交区，其中所述间隔区序列为所述双链体的5'，和

突起区，所述突起区不是后接第一茎，其中所述突起区包含不成对核苷酸区，并且其中所述突起区在所述突起区的最小CRISPR重复序列一侧包含不成对嘌呤；

单导向接头序列，所述单导向接头序列连接所述双链体的端部以形成发夹结构；和

3'tracr序列。

2.如权利要求1所述的工程改造的以核酸为靶的单导向核酸，还包含接头序列，所述接头序列连接所述双链体与中间-tracrRNA，其中所述中间-tracrRNA包含第二茎和任选的第三茎。

3.如权利要求1或2所述的工程改造的以核酸为靶的单导向核酸，其中所述突起区是突变的。

4.如权利要求1-3中任一项所述的工程改造的以核酸为靶的单导向核酸，其中所述最小CRISPR重复序列和最小tracr序列之前的杂交区包含不多于2个错配。

5.如前述权利要求中任一项所述的工程改造的以核酸为靶的单导向核酸，其中所述最小CRISPR重复序列的长度为6-15个核苷酸。

6.如前述权利要求中任一项所述的工程改造的以核酸为靶的单导向核酸，其中所述最小CRISPR重复序列的长度为12个核苷酸。

7.如前述权利要求中任一项所述的工程改造的以核酸为靶的单导向核酸，其中所述最小tracr序列的长度为14个核苷酸。

8.如前述权利要求中任一项所述的工程改造的以核酸为靶的单导向核酸，其中所述突起区在所述双链体的一侧包含不成对5'-XXXY-3'，其中X是任何嘌呤，Y是能与相对链上的核苷酸形成摆动配对的核苷酸。

9.如前述权利要求中任一项所述的工程改造的以核酸为靶的单导向核酸，其中所述突起序列在所述双链体的一侧包含4个不成对核苷酸。

10.如前述权利要求中任一项所述的工程改造的以核酸为靶的单导向核酸，其中所述单导向接头序列的长度为4-40个核苷酸。

11.如权利要求10所述的工程改造的以核酸为靶的单导向核酸，其中所述单导向接头序列的长度为3-约10个核苷酸。

12.如前述权利要求中任一项所述的工程改造的以核酸为靶的单导向核酸，其中所述工程改造的以核酸为靶的单导向核酸包含DNA。

13.如前述权利要求中任一项所述的工程改造的以核酸为靶的单导向核酸，其中所述工程改造的以核酸为靶的单导向核酸包含RNA。

14.编码前述权利要求中任一项所述的工程改造的以核酸为靶的单导向核酸的多核苷酸。

15.如权利要求14所述的多核苷酸，还包含与所述多核苷酸操作性连接的启动子。

16.组合物，其包含：

权利要求1-13中任一项所述的工程改造的以核酸为靶的单导向核酸；和

Cas9蛋白，

其中所述工程改造的以核酸为靶的单导向核酸和所述Cas9蛋白形成复合物。

17.如权利要求16所述的组合物，其中所述Cas9蛋白是化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9蛋白。