[发明专利]一种带有盖玻片的显微标本的对焦方法

说明书

本发明公开了一种低对比度标本的对焦方法，属于显微技术领域，用于提高低对比度标本自动对焦的成功率。本发明在盖玻片上增加特定的图案，在对焦时先找到这几个图案的焦面位置，然后以这些焦面位置拟合出一个平面作为参考面，并结合图案和标本的厚度设定上下限，在此范围内对标本进行对焦，这样可以确保不会对焦到非标本上，同时有效提高对焦的速度和成功率。

技术领域

本发明属于显微技术领域，具体来说，是一种提高低对比度标本自动对焦的成功率。

背景技术

光学显微镜是利用光学透镜放大原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器，光学显微镜的发明是人类历史上取得的一项重大成就，它使得人们能够看到放大上千倍的肉眼所不能看见的精细结构。在医疗、教学、工业、科研等多领域得到广泛的应用。观察的标本也各种各样，其中那种带有盖玻片的低对比度标本，如纤维标本、脂肪组织标本、荧光标本等，由于有标本的区域和非标本的区域差异不明显，在自动显微镜进行自动对焦时容易出现以下两种问题：一是可能找到盖玻片之外的地方即非有效观察区域，找不到标本，还可能导致Z轴过度调整使物镜压到载玻片上，从而损坏标本，二是有可能对焦到盖玻片上的脏点，导致标本都是模糊的。这时，一般是改用人工手动对焦，导致自动化程度不高，特别是在利用自动显微镜对这类标本进行数字化时，需要人工重新扫描，影响效率。

现有技术专利US2018/0373014A1公开了：用于显微镜观察的载玻片包括：配置标签的标签区域，配置观察标本的盖玻片区域，在标签区域与盖玻片之间的空白区域配置的位置基准标记区域，并且被指定为指定切片的参考位置以及彼此正交的X轴方向和Y轴方向，以及沿着参考区域的周围的两个相对侧重复地布置有预定图案的聚焦参考标记。但该专利要求标本及盖玻片必须放置在此标记限定的范围内，操作起来有一定难度；盖玻片尺寸规格有多种，通用性不强；这些标记上没有盖玻片，实际焦面会有差别，因此需要亟待改进此类技术。

发明内容

本发明旨在提供一种带有盖玻片的显微标本的快速对焦方法，其特征在于：在盖玻片的下表面打印上特定图案，将盖玻片下表面朝着载玻片上的标本盖上，盖玻片上表面朝物镜，具体步骤如下：

第一步、用低倍光学图像采集装置快速获取整个载玻片的低分辨率图片作为宏观图片，根据特定图案及其位置，和盖玻片的尺寸参数，获得盖玻片的位置；

第二步、对盖玻片上特定图案进行对焦，获得盖玻片上的几个特定图案的焦面位置以确定一个参考面；

第三步、在参考面附近对标本进行对焦：以参考面为基准，加上和减去某个偏移量分别作为上限和下限，在此范围内对标本进行自动对焦。

进一步，所述的盖玻片上的特定图案，至少在1个位置上设置，优选的至少在3个位置上设置。

所述的特定图案的可以多种，如圆形、四边形、三角形等构成的阵列，最小特定图案的尺寸要小于所用物镜的物方视场，确保在物方视场内有明暗图案。

所述的特定图案可以分布在任何位置，优选的特定图案分布在盖玻片的边缘，这样可以减少对标本的遮挡。

所述的盖玻片上的特定图案朝着载玻片上的标本贴着。

进一步，所述的盖玻片的位置，可以通过识别盖玻片上的图案及位置，再结合盖玻片的尺寸参数，以确定盖玻片的位置；由于盖玻片上的图案位置是已知的，只要通过识别出这些特定图案及其位置，再结合盖玻片的尺寸参数，可以确定盖玻片的位置。

所述的盖玻片的位置，可以根据该特定图案的分布位置及盖玻片的边长来确定，至少有如下几种方法：

第一、只有1个特定图案时，优选的放置在盖玻片的中心，可以根据此图案及盖玻片的边长来确定盖玻片位置；

第二、有2个特定图案时，优选的放置在盖玻片的其中两个对角上，可以根据这2个对角的图案确定盖玻片位置；