[发明专利]基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法

权利要求书

1.一组基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种用InDel分子标记，其特征在于：所述InDel分子标记包括如下81个引物位点及其所对应的正向和反向引物：

2.一种基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，其特征在于：所述鉴定方法包括以下步骤：

S1、利用二代测序技术对金兰柚样品进行基因组重测序；以晚白柚为参考基因组，将测序得到的片段与参考基因组序列进行比对；

S2、利用设定的参数进行InDel标记筛选；

S3、挑选200个InDel位点设计引物并进行PCR检测，最后在全基因组范围内共筛选出81对杂合位点作为用于鉴定的标记；

S4、利用S3筛选出的标记进行染色体定位和基因序列注释，实现对金兰柚品种的鉴定。

3.根据权利要求2所述的基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，其特征在于：所述步骤S2中的参数包括(1)变异位点的QUAL大于400；(2)变异位点的GQ值为99；(3)InDel插入或者缺失的长度大于100bp；(4)覆盖深度大于20层。

4.根据权利要求2所述的基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，其特征在于：所述步骤S1中金兰柚样品重测序及数据分析具体为：样品基因组DNA检测合格后，用机械打断的方法将DNA片段化，然后对片段化的DNA进行片段纯化、末端修复、将‘A’碱基加入到DNA片段的3’端，连接测序接头，将连接产物环化后直接进行文库检测，质检合格的文库用BGISEQ-500WGS进行测序，运用BWA软件将测序得到的片段与参考基因组序列进行比对；通过SAMtools和GATK进行变异检测。

5.根据权利要求2或3所述的基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，其特征在于：所述步骤S2中标记筛选的具体操作为：利用python中封装完成的PyVCF库进vcf文件的读取，获取标记的染色体和位置信息以及基因型信息，以基因型为杂合0/1类型、变异位点的QUAL大于400、变异位点的GQ值为99InDel插入、覆盖深度大于20、缺失的长度大于100bp为参数进行过滤，根据REF和ALT的长度作为判断条件进行序列注释，如果REF长度大于ALT，则表明样品中缺失了一段序列，如果REF长度小于ALT，则表明样品中插入了一段序列；利用python库中封装好的pysam进行insetion位置侧翼200bp序列抓取，将deletion位置的侧翼200bp加上删除的序列长度进行抓取，形成fasta格式的文件，结合Primer3.0设计InDel标记的扩增引物。

6.根据权利要求2所述的基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，其特征在于：所述步骤S3操作具体为：根据预测的InDel位点，以杂合标记的基因型过滤，并以琼脂糖凝胶电泳条带大于100bp为条件进行筛选和引物设计，选取200个InDel位点设计引物合成，以金兰柚样品对上述引物进行扩增效果评价。

7.根据权利要求2或6所述的基于全基因组InDel标记鉴定金兰柚品种的方法，其特征在于：所述PCR检测中PCR反应体系为10μl：5μl 2x Taq plus master mix，0.25μl正向引物，0.25μl反向引物，150ng DNA模板，并用水补足至10μl；

PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，Tm 55℃退火30s，72℃延伸30s，反应进行35个循环；最后72℃再延伸5min；

琼脂糖凝胶电泳采用1.5％～2％质量百分比的琼脂糖凝胶，电压120V，电泳15～20min。