[发明专利]一种构建赤点石斑鱼神经坏死病毒反向遗传系统的方法

说明书

本发明属于水生动物病毒基因工程技术领域，具体涉及一种构建赤点石斑鱼神经坏死病毒（red‑spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV）反向遗传系统的方法。本发明以CMV为启动子构建含RGNNV基因组的真核表达质粒，采用高转染效率的人胚肾293T细胞和对RGNNV高效复制的条纹月鳢细胞（striped snakehead cell,SSN‑1）组合的方法来拯救RGNNV，克服了鱼类细胞转染效率低的问题。

技术领域

本发明属于水生动物病毒基因工程技术领域，具体涉及到一种构建赤点石斑鱼神经坏死病毒反向遗传系统的方法。

背景技术

鱼类神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)是野田病毒(Nodaviridae)家族的一员。其感染导致的疾病称为病毒性神经坏死症(viral nervous necrosis,VNN)或者病毒性脑病和视网膜病(viral encephalopathy and retinopathy,VER)。现在已在120多种不同的养殖和野生鱼类中被报道，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。2001年，林蠡等在中国广东省大亚湾自然发病的赤点石斑鱼鱼苗中分离出病毒，为赤点石斑鱼神经坏死病毒(red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)。RGNNV为正链RNA病毒，病毒基因组包含两节段RNA(RNA1和RNA2)。RNA1编码病毒RNA聚合酶，RNA2编码病毒的唯一结构蛋白—衣壳蛋白。目前RGNNV的致病机制不完全清楚，因此，揭示RGNNV的致病机制及研制有效疫苗迫在眉睫。

反向遗传系统已经广泛应用于病毒学研究的各个领域，是研究病毒致病机制及研制疫苗的重要技术手段。在弹状病毒中，最先建立反向遗传系统的是狂犬病毒(1994年)。随后，水泡性口炎病毒、传染性造血器官坏死病病毒、病毒性出血性败血症病毒、乌鳢水泡病毒都建立了反向遗传系统。弹状病毒的反向遗传系统最开始是采用T7聚合酶启动子，因而细胞中需要通过感染痘苗病毒来提供T7聚合酶或者建立稳定表达T7聚合酶的细胞系；后来，逐渐采用CMV启动子。CMV启动子依靠RNA聚合酶II驱动，很多动物细胞内都含有RNA聚合酶II。因此，不需要像T7聚合酶启动子那样额外表达T7聚合酶，使得病毒拯救更便捷。2001年日本学者Naoki采用T7聚合酶启动子成功建立了RGNNV的反向遗传操作系统，但是目前还没有采用CMV启动子建立RGNNV反向遗传操作系统的报道。此外，鱼类病毒的反向遗传系统在使用细胞系方面，一般采用对病毒高效增殖的鱼类细胞进行质粒转染。然而，很多鱼类细胞因为转染效率很低，成为病毒拯救过程中的限制因素。因此，我们以CMV启动子构建含RGNNV基因组的真核表达质粒，采用人293T细胞(利用其转染效率高的特点)和条纹月鳢细胞SSN-1(利用其对RGNNV高效复制的特点)组合的方法来拯救病毒RGNNV，成功拯救出RGNNV。本发明的创新之处：以CMV启动子构建含RGNNV基因组的真核表达质粒，利用人293T细胞-鱼SSN-1细胞组合的方法进行RGNNV拯救，克服了鱼类细胞转染效率低的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)反向遗传系统的方法，以CMV启动子构建含RGNNV基因组的真核表达质粒，采用人293T细胞和条纹月鳢细胞SSN-1组合的方法来拯救病毒RGNNV。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种构建赤点石斑鱼神经坏死病毒RGNNV反向遗传系统的方法，包括以下步骤：

1)提取RGNNV的RNA并反转录成cDNA，PCR扩增RGNNV基因组，连接到含CMV启动子的质粒载体，载体上含有锤头状核酶HamRz和丁型肝炎核酶HdvRz序列；

2)将构建的含RGNNV基因组的真核表达质粒共转染293T细胞，拯救RGNNV；

3)收集转染后的293T细胞，冻融后离心取上清，转接条纹月鳢细胞SSN-1，拯救的RGNNV在SSN-1细胞中大量增殖。