[发明专利]具有酶解稳定性和镇痛活性的环状内吗啡肽-1类似物及其应用

权利要求书

1.一类具有酶解稳定性和镇痛活性的环状内吗啡肽-1类似物，其特征在于，所述环状内吗啡肽-1类似物是以ZH853为模板，分别对其2位D-Lys进行D-Dap取代和/或6位Gly末端羧酸化修饰得到，记为Analog3，Analog4和Analog5；其序列及结构式如下：

Analog3：Tyr-c(D-Lys-Trp-Phe-Glu)-Gly-OH，

Analog4：Tyr-c(D-Dap-Trp-Phe-Glu)-Gly-OH，

Analog5：Tyr-c(D-Dap-Trp-Phe-Glu)-Gly-NH₂；

2.如权利要求1所述的一类具有酶解稳定性和镇痛活性的环状内吗啡肽-1类似物的合成方法，其特征在于，先采用经典的固相合成方法合成直线肽，然后对直线肽的侧链脱保护后环化，具体包括以下步骤：

(1)直线肽的固相合成：将0.3mmol的Rink amide MBHA树脂置于固相合成仪中，加入10mL重蒸DCM溶胀激活，DMF洗脱DCM后，茚检树脂状态良好的情况下采用DMF洗脱茚检试剂；依次加入0.45-0.9mmol的Fmoc保护的环状内吗啡肽-1类似物的1位氨基酸、HOBt、HBTU，以及0.1-0.3mL的DIEA的DMF溶液，于惰性气体保护下反应40-60min；DMF洗脱反应体系中未反应的药品和试剂后茚检氨基酸是否连接至树脂上；此后2-6位氨基酸的接入与上述过程相同，得到直线肽；

(2)直线肽的环化：将步骤(1)中连接有直线肽的树脂转移至圆底烧瓶中，磁力搅拌下以1g树脂对应15mL溶剂加入体积比为37:2:1的CCl₄、HAC和NMM的混合溶液，避光、惰性气体保护下加入0.0825-0.165mmol的Pd(PPh₃)₄为脱除试剂、0.75-1.5mmol的DABCO为脱除溶剂，反应6-8h，直至脱除直线肽中D-Lys或D-Dap侧链的烯丙氧羰基和Glu侧链的烯丙基保护；DMF洗除Pd(PPh₃)₄和DABCO直至树脂茚检呈蓝紫色，以DMF为溶剂，依次加0.45-0.9mmol的PyBOP、HOBt、HBTU和0.1-0.3mL的DIEA进行环化，直至茚检树脂呈无色，得到附着有环状内吗啡肽-1类似物粗品的树脂；

(3)树脂上环状内吗啡肽-1类似物粗品的脱除：将树脂置于合成仪中，TFA、TIS和ddH₂O以体积比9.5:0.25:0.25混匀后，缓慢加入合成仪，每20min搅拌1min，反应2.5-3h后用橡胶手套及橡皮塞将体系封闭，并将反应液用洗耳球压入圆底烧瓶，旋蒸后得到环状内吗啡肽-1类似物粗品；

(4)环状内吗啡肽-1类似物粗品的萃取：将盛装有环状内吗啡肽-1类似物粗品的圆底烧瓶于-20℃下预冷10-15min，并将乙醚冰浴预冷15-20min后，继续于冰浴中量取60mL冰乙醚至圆底烧瓶中，静置，待环状内吗啡肽-1类似物完全析出，得到上层清液和沉淀物；取上层清液至第一分液漏斗中，加入ddH₂O，重复振荡、放气操作至有机相与水相界面清晰可辨，将水相放至盛装沉淀物的圆底烧瓶中，弃去有机相；摇晃圆底烧瓶，待环状内吗啡肽-1类似物溶解后加入第二分液漏斗中，重复振荡、放气操作至有机相与水相界面清晰可辨，将水相放至烧杯1中，同时用ddH₂O超声清洗圆底烧瓶，清洗液转至第二分液漏斗中，重复振荡、放气操作至有机相与水相界面清晰可辨，将水相放至烧杯2中，弃去有机相；最后将烧杯1、2置于通风橱中挥去乙醚后置于-80℃冰箱冷冻，得到环状内吗啡肽-1类似物冻干粉；

(5)环状内吗啡肽-1类似物的RP-HPLC纯化：将上述环状内吗啡肽-1类似物冻干粉以体积比为1:4的乙腈水溶液溶解，和/或加入1-2滴甲醇助溶，过0.45μm滤头得到上样样品；以220nm、254nm、280nm为紫外检测波长，采用线性梯度洗脱：洗脱液乙腈:水体积比为10:90-90:10，流速为0.8mL/min，上样前平衡10-15min，待基线平稳无杂峰后，进样4.8mL，根据检测波长所显示的出峰时间及面积收集所需样品，得到环状内吗啡肽-1类似物纯品。

3.如权利要求1所述的一类具有酶解稳定性和镇痛活性的环状内吗啡肽-1类似物在制备临床镇痛药物中的应用。