[发明专利]一种铜绿假单胞菌生物膜及其制备方法、应用

说明书

本发明属于高分子技术领域，公开了一种铜绿假单胞菌生物膜及其制备方法、应用，将细菌接种于琼脂平板上，挑取单个菌落接种于5mLLB培养液中振摇后将菌液离心，弃上清，细菌沉淀用无菌生理盐水洗涤，将细菌悬浮液用生理盐水调整菌液备用；在50ml锥形瓶里加入10ml上述备好的实验菌株菌液，加入10个载体，在37℃，110rpm恒温震荡培养20h使细菌粘附。体外培养铜绿假单胞菌生物膜结构，在调好浓度的细菌悬液内放入载体培养出生物膜结构，然后检测调整细菌浓度。这样的细菌生物膜结构稳定，重复性好。将准备好的载体移植入小鼠腹腔造成铜绿假单胞菌生物膜感染，然后研究其致病机制和温和灸干预治疗的效果。

技术领域

本发明属于高分子技术领域，尤其涉及一种铜绿假单胞菌生物膜及其制备方法、应用。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：细菌生物膜(biofilm，BF)相关感染是一种广泛存在、涉及多学科的疾病。BF是指细菌吸附于固体物质表面后(如医用有机材料或机体黏膜表面)，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白等多糖-蛋白复合物，使细菌相互粘连并将其自身菌体包裹于生物被膜之中，从而形成致密的膜样状态,是细菌的三维聚集体。随着生物医学材料的广泛使用，与细菌生物被膜有关的临床感染也日益增多，据统计65％的人类细菌感染与生物被膜有关，其中铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.a)是极为常见的细菌BF相关感染病原菌之一。许多慢性的难以治疗的感染，如慢性泛细支气管炎、囊性纤维化、慢性尿道感染等均与BF形成密切相关。由于P.a对多种抗生素(如某些β-内酞胺类、喹诺酮类、四环素类及氯霉素等)耐药，因此给临床治疗造成许多困难。P.a耐药的原因之一就是BF的形成。因此P.a生物被膜耐药性的研究己成为医学、微生物学、药学等众多领域关注的热点课题。于BF相关感染的防治措施，国内外研究主要集中在大环内酯类抗生素(红霉素、罗红霉素、阿奇霉素、克拉霉素等)、妥布霉素、米诺霉素、头孢他啶、喹诺酮类抗菌素左氧氟沙星、环丙沙星等对BF的抑制作用。但是长期低剂量应用抗菌素有增加细菌对抗菌素耐药的潜在危险。铜绿假单胞菌生物膜体外的模型制备技术已经基本成熟，体外制备的细菌生物膜载体移植到腹腔的手术比较成功，但是相关抗生素、中药等的干预疗效一直不理想。中医临床和实验研究都发现温和灸能明确增强机体的抵抗力，增强免疫功能，尤其是细胞免疫功能，而这恰好是前期研究发现能治愈这类感染的方向。现在研究人员都在专注铜绿假单胞菌生物膜感染的西药抗生素和中药的治疗，有一定疗效，但是很难治愈，而且经济负担大，还易引起菌群失调。而中华几千年传承的中医艾灸治疗，安全有效，经济实惠，治疗过程病人主观感受轻松舒适，在不知不觉中疾病就会慢慢好转，治愈。已经有研究明确艾灸对哮喘，炎症性肠病，类风湿性关节炎等的疗效。但是，还没有对铜绿假单胞菌生物膜感染的研究。

综上所述，现有技术存在的问题是：铜绿假单胞菌生物膜感染的西药抗生素耐药现象一中，和中药的治疗有一定疗效，但是很难彻底治愈，而且经济负担大，还可能引起菌群失调，肝肾损害等。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种铜绿假单胞菌生物膜及其制备方法、应用。

本发明是这样实现的，一种铜绿假单胞菌生物膜的制备方法，所述铜绿假单胞菌生物膜的制备方法包括以下步骤：

步骤一，将细菌接种于琼脂平板上，挑取单个菌落接种于5mLLB培养液中37℃，200rmin^-1振摇20h后将菌液3000rmin^-1离心10min，弃上清，细菌沉淀用无菌生理盐水洗涤2次，将细菌悬浮液用生理盐水调整OD600＝0.05菌液备用；

步骤二，在50ml锥形瓶里加入10ml上述备好的实验菌株菌液，加入10个载体，在37℃，110rpm恒温震荡培养20h使细菌粘附。

本发明的另一目的在于提供一种所述铜绿假单胞菌生物膜的制备方法制备的铜绿假单胞菌生物膜。

本发明的另一目的在于提供一种由所述铜绿假单胞菌生物膜制备的慢性难治性疾病药物。