[发明专利]一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法

权利要求书

1.一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、上清液分离，对干细胞进行培养，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质，分离出培养上清液；

步骤二、初提取，将步骤一所述的培养上清液与外泌体提取液混合后进行培育，培育后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；

步骤三、二次提取，将步骤二所述含外泌体的浓缩液加入无菌PBS溶解后加入外泌体提取液进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得细胞外泌体；

步骤四、培养基纯化培养，将得到的细胞外泌体转移到纯化培养基上进行除杂纯化；

步骤五、诱导分化，将步骤四所得到的纯化细胞外泌体接种于新的I型胶原包被的细胞板中，采用MSC培养液进行培养，培养过后放到分化培养基上进行诱导分化；

步骤六、冷冻储存，对培养后的干细胞外泌体进行深低温冷藏。

2.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法，其特征在于：所述步骤一中，将间充质干细胞进行传代培养，从中筛选出细胞状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，将不含外泌体血清的干细胞ɑ-MEM空白培养基加入所述筛选的间充质干细胞中,24小时至48小时后收取细胞培养上清液即为条件培养基。

3.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法，其特征在于：所述步骤二中，将培养上清液与Total exosome Isolation外泌体提取液以体积比为2:1进行混合后，在4℃条件下孵育8小时至12小时，孵育后得到第一孵育液，并在4℃，10000g条件下离心60min得到含有干细胞外泌体的浓缩液。

4.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法，其特征在于：所述步骤五中，分化培养基由两部分组成，分化培养基A是在基础培养基中添加血小板衍生因子（PDGF AB）、地塞米松和10%胎牛血清（FBS）的培养基；分化培养基B为分化培养基A和mTeSR1培养基的混合液；所述细胞培养板为I型胶原蛋白包被细胞培养板对培养后的干细胞外泌体采用促细胞生长剂3CS-NK-B1和3CS-NK-B2进行诱导生长。

5.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法，其特征在于：所述步骤五中，MSC培养液为基础培养基中添加FBS、GlutaMAX-I和非必需氨基酸的培养基。

6.根据权利要求1所述的一种干细胞外泌体的提取、纯化及扩增的方法，其特征在于：所述步骤六中，在进行冷冻储存时，需要在-80℃的环境下对所提取的干细胞外泌体进行保存。