[发明专利]一种来源于发育早期中胚层的间充质干细胞制备方法

权利要求书

1.一种来源于发育早期中胚层的间充质干细胞制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤A：清洗，将脐带提取出来，用蒸馏水清洗脐带，并用消过毒的海绵擦拭；

步骤B：酶解，取出脐带进行粉碎处理，并使用浓度为1％胶原酶进行酶解，时间为7小时；

步骤C：过滤，向脐带酶解液中带入5倍体积的蒸馏水，使用筛网进行初步过滤，然后倒入差速分离机中进一步过滤；

步骤D：原代培养，将过滤后的脐带细胞接种到无血清基础培养基中进行培养，釆用克隆悬浮法，制备新型培养液进行体外扩增培养直至第三代；

步骤E：传代培养，更换无血清培养基，并在无血清培养基中添加无血清营养添加物，定期更换培养基，直至产生细胞簇；

步骤F：诱导分化，将第三代的细胞提取出来，并利用平板划线法将其接种到分化培养基上进行培养；

步骤G：冷冻保存，将制备的细胞进行冷冻低温保存。

2.根据权利要求1所述的一种来源于发育早期中胚层的间充质干细胞制备方法，其特征在于：所述步骤A中，选取的脐带在酶解前应切成小块放入保温罐中冷藏，冷藏持续时间为2～6个月。

3.根据权利要求1所述的一种来源于发育早期中胚层的间充质干细胞制备方法，其特征在于：所述步骤D中，干细胞在体外扩增培养过程中采用克隆悬浮法，即每个培养板上每个孔加入等量的细胞悬液，带神经球形成后再次机械分离克隆制作单细胞悬液，神经干细胞克隆后传代培养大小为200卩m，其培养液为DMEM/F12(1:1)加B27和bFGF无血清培养基，原代培养细胞达到85%融合时,采用0. 25%胰蛋白酶在37°C的环境下消化30min。

4.根据权利要求1所述的一种来源于发育早期中胚层的间充质干细胞制备方法，其特征在于：所述步骤C中，利用台式离心机和生物安全柜恒温磁力搅拌机分离细胞，且离心时方法为lOOOrpm，5min，且在分离时加入多聚赖氨酸。

5.根据权利要求1所述的一种来源于发育早期中胚层的间充质干细胞制备方法，其特征在于：所述步骤F中，在分化过程中采用多能干细胞分化基础培养基和添加剂混合，其中每10mL添加剂与500mL分化基础培养基彻底混匀即为人多能干细胞分化培养基（AC-1001002），人多能干细胞分化培养基可在2-8℃稳定储存2-3周。