[发明专利]一种稀土上转换纳米探针标记病毒的构建方法

说明书

本发明公开一种稀土上转换纳米探针标记病毒的构建方法，包括如下步骤：1)包膜生物素化的流感病毒的制备；2)链霉亲和素化稀土上转换纳米探针的合成；3)利用链霉亲和素化稀土上转换纳米探针标记包膜生物素化的病毒。制备的稀土上转换纳米探针可与包膜生物素化的仙台病毒结合，实现病毒包膜的标记。本发明的病毒包膜标记技术，可实现90％的病毒标记效率，稀土上转换纳米探针在980nm近红外光激发下可发射波长540nm的绿色荧光，可用于在共聚焦显微镜下观察。

技术领域

本发明属于生物技术和材料技术领域，具体涉及一种稀土上转换纳米标记病毒的构建方法。

背景技术

目前标记病毒的方法主要利用荧光蛋白、有机染料及量子点纳米颗粒，但这些标记方法存在一定的局限性：如荧光蛋白表达周期较长、操作步骤繁琐、标记病毒后对其活性影响较大，且荧光蛋白自身荧光偏弱、易光漂，不利于进行长期示踪；有机荧光染料发射光谱宽、光稳定性较差，长时间实时荧光监测相对困难；量子点应用于活体病毒示踪时，仍存在可见光穿透性差、荧光寿命短及背景噪音高等局限。上转换发光材料是一种吸收长波长光而发射出短波长光的一种材料，具有良好的组织穿透性。与传统的生物荧光探针相比，稀土上转换纳米粒子发光亮度高、荧光寿命长(毫秒量级)、光稳定性好、抗漂白性强、穿透深度深、无背景荧光干扰，更适用于病毒标记。我们以流感病毒为例，研发一种利用稀土上转换纳米探针标记流感病毒包膜的方法，这种方法具备良好的标记效率，更方便应用于后续活体的病毒侵染机制探讨等研究。

发明内容

本发明为克服现有技术的缺陷，提出了一种具有高标记效率的一种稀土上转换纳米颗粒标记流感病毒的方法。包括如下步骤：

1)包膜生物素化的流感病毒的制备；

2)链霉亲和素化稀土上转换纳米探针的合成；

3)利用链霉亲和素化稀土上转换纳米探针标记包膜生物素化的流感病毒。

所述步骤1)中包膜生物素化的流感病毒制备的具体步骤：

(1)在直径10cm的细胞培养皿中培养MDCK细胞，向培养基中加入DSPE-PEG2000-Biotin试剂(终浓度为5μg/ml)，将培养皿置于37℃二氧化碳孵箱中培养18-24h。

(2)当培养皿中细胞密度生长至80-90％时，弃去培养基，用无血清培养基清洗细胞2次除去残余血清，加入5ml无血清培养基和10μl流感病毒浓缩液，混匀后置于37℃二氧化碳孵箱中孵育2h，每半个小时轻摇培养皿。

(3)孵育完成后弃去上清，加入含2％FBS和DSPE-PEG2000-Biotin的完全培基。将培养皿置于37℃二氧化碳孵箱中培养48-72h。

(4)至细胞死亡50％时，收集细胞和上清于离心管中，在-80℃冰箱和常温环境中反复冻融3次使细胞完全破碎。使用0.22μm滤膜过滤后4℃3000rpm离心30min除去细胞碎片。

(5)将滤液加至预先装有2ml 20％蔗糖溶液的超速离心管中，100000g离心2h后弃去上清。加入300μl PBS溶液重悬沉淀，即可获得包膜生物素化的流感病毒。

所述步骤2)链霉亲和素化稀土上转换纳米探针合成的具体步骤：

(1)表面羧基化稀土上转换纳米颗粒由北大合作实验室提供。制备1mg/ml稀土上转换纳米颗粒，取100μl向其中加入EDC和NHS各2mg，旋转过夜后12000rpm离心20min，弃上清。

(2)加入100μl ddH2O重悬沉淀，加入50μl 1mg/ml链霉亲和素，旋转混匀2h。

(3)反应完成后12000rpm离心20min，弃上清，加入100μl ddH2O重悬即获得链霉亲和素化的稀土上转换纳米探针。