[发明专利]基于局部（表面）两亲性的聚D-脯氨酸及其制备方法与应用

说明书

本发明公开基于局部(表面)两亲性的聚D‑脯氨酸及其制备方法与应用，采用溶液缩聚方法合成制备聚D‑脯氨酸的均聚多肽。该聚合物具备一定程度的IRI活性和TH效应，且生物相容性好、用量低，在作为冷冻低温保护剂方面有一定应用前景。

技术领域

本发明属于生物蛋白技术领域，更加具体地说，涉及一种具有局部(表面)两亲性聚合物及其制备方法，其单体和聚合物分别可视为一种最小的抗冻肽和抗冻蛋白模拟物。

背景技术

随着组织工程、蛋白质工程和基因疗法等新兴的可再生医学技术的快速发展，对如何保存细胞、组织和器官提出了新的、更高的要求。目前常用的低温保存方法主要是依靠添加大量的小分子冷冻保存剂，如DMSO、PVA和甘油等，然而研究已经证实，上述物质对细胞、组织等均存在一定毒副作用，如DMSO的长期低温保存会使DNA发生一定程度的甲基化，影响细胞等传代过程，而甘油也存在用量过大(30wt％)且后续去除步骤复杂繁琐等缺点。开发新的无毒副作用、生物相容性好且用量低的抗冻物质具有很大的现实意义。

人们在北极等寒冷地区鱼类中发现了一种能在低温下保护生命体免受冻伤的抗冻(糖)蛋白(AF(G)Ps)，它能够调节冰的形成和生长，可以在含量极低的状况下，为生命体提供优异的抗冻耐低温性能。近年来研究发现，AF(G)Ps主要有三种效应：1.动态冰塑造(DIS)效应，即AF(G)Ps会促使冰晶的生长为针刺状，已经证明，这对细胞等保存是不利的；2.热滞(TH)效应，即冰点的非平衡降低，导致冰点低于熔点，即冰点与熔点之间存在一个差值；3.冰再结晶抑制(IRI)效应，即对冰再结晶的动力学过程抑制，从而抑制冰晶的生长。虽然AF(G)Ps具备优异的抗冰防冻作用，但是由于其潜在的免疫原性及毒性作用和DIS效应，使其应用受到很大限制。根据AF(G)Ps的结构和空间构象，研究开发具有可调和定制功能的合成模拟物具有广泛的应用前景。

近年来，人们不断加大AF(G)Ps模拟物的研究，已经开发出多种具有低毒副、用量低且抗冻保存效果较好的模拟肽。如Ben及其同事报道了一种C端连接半乳糖基丝氨酸和甘氨酸的糖肽具有高效的IRI活性且所需浓度很低(Liu,Suhuai,et al.In vitro studiesof antifreeze glycoprotein(AFGP)and a C-linked AFGP analogue.Biomacromolecules 8.5(2007):1456-1462.)；Gibson及其同事报道的表面两亲性甘油聚合物，具备分离的亲水和疏水域，具有较好的IRI活性(Graham,Ben,et al.Faciallyamphipathic glycopolymers inhibit ice recrystallization.Journal of theAmerican Chemical Society 140.17(2018):5682-5685.)。

目前文献中关于合成AF(G)Ps模拟物的方法多种多样，包括ATRP、RAFT、ROMP、自由基聚合等方法。关于分子结构设计的出发点主要涉及到模拟物表面两亲结构域、含氧官能团(羟基和环氧基)等方面。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有生物相容性，基于局部(表面)两亲性的P(D-Pro)_n的制备方法和应用。本发明采用溶液缩聚方法合成制备聚D-脯氨酸(P(D-Pro)_n)的均聚多肽。该聚合物具备一定程度的IRI活性和TH效应，且生物相容性好、用量低，在作为冷冻低温保护剂方面有一定应用前景。

本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现。

基于局部(表面)两亲性的聚D-脯氨酸及其制备方法，按照下述步骤进行：将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、D-脯氨酸和2-肟氰乙酸乙酯均匀分散在有机溶剂中，在惰性保护气体氛围下进行反应，反应温度为室温。