[发明专利]一种抗植物病毒嘧肽霉素及其制备工艺和应用

权利要求书

1.一种抗植物病毒嘧肽霉素的制备工艺，其特征在于：按如下步骤依次进行：

(A)菌种扩繁过程：采用不吸水链霉菌，学名为Streptomyces ahygroscopicus TZ92，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.1245，在种子罐中加入培养组分对菌种进行培养；

(B)发酵抗生素生成过程：将A步骤形成的培养液送入发酵罐进行发酵；在发酵罐内加入培养基；然后灭菌前调整pH值使其控制在6.0～7.0；

(C)抗生素分离提取工艺：

该不吸水链霉菌经液体发酵培养后，发酵液通过离心、滤膜过滤去除菌丝体和培养基组分，收集上清液，用XAD-16大孔树脂对上清液中活性物质进行吸附，然后用10％-70％甲醇浸泡树脂，经二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷相，浓缩后获得粗提物；对此粗提物进行硅胶柱层析，获得不同样本，对不同样品分别进行薄层层析，再将相同的物质进行合并，重新得样品，编号；采用半叶法测定这些样品对病毒的生物活性，筛选出抗病毒最好的样品，对其经过制备型高效液相色谱反复制备分离，获得单体化合物纯品，即嘧肽霉素，该嘧肽霉素化学名称是6-(5-羟基-6-甲基庚基)-5,6-二氢-2H-吡喃-2-酮，化学结构式为：

分子式为C₁₃H₂₂O₃，其分子量为226。

2.根据权利要求1所述的抗植物病毒嘧肽霉素的制备工艺，其特征在于：

步骤A中培养组分包括，按重量百分含量计：花生饼粉1.5～5.0；可溶性淀粉2.5～5.0；酵母粉0.05～0.5；葡萄糖0.1～0.3；氯化钠0.1～3.0；硫酸铵0.1～3.0；碳酸钙0.5～3.0；其余含量为水，灭菌20分钟～40分钟备用；培养条件：在种子罐中培养25小时～40小时；其温度控制在25℃～35℃，用1mol/L的盐酸或氢氧化钠将pH调节为6.0～7.5，罐压控制在0.05～0.25Mpa；

步骤B中的培养基具体组分包括：按重量百分含量计：花生饼粉2.0～5.0；淀粉1.0～5.0；酵母粉0.1～0.2；葡萄糖0.1～2.0；硫酸铵0.2～0.4；碳酸钙0.05～0.4；氯化钠0.2～0.4；其余含量为水。

3.根据权利要求1所述的抗植物病毒嘧肽霉素的制备工艺，其特征在于：

上罐接种量7.5％～15％V/V，液体种子的种龄为培养30～40小时，发酵罐中加消泡剂乙二醇硅氧烷0.2～0.8/万V/V，

步骤B中培养时罐压控制在0.05～0.25MPa，空气流量1：(0.2～1.0)，培养温度为26～32℃，时间为30小时～60小时；获得富含抗生素的发酵液。

4.根据权利要求1所述的抗植物病毒嘧肽霉素的制备工艺，其特征在于：收集发酵液离心后留上清液，然后加入2％～8％的XAD-16大孔吸附树脂进行对发酵液中的活性物质进行吸附，28℃、120rpm振荡4h；再用蒸馏水将树脂冲洗干净，放入烘箱，在28℃下烘干，期间用玻璃棒不断翻搅树脂，加速树脂干燥；将烘干的树脂放入分液漏斗中，然后向分液漏斗中加入20％～80％甲醇，反复颠倒分液漏斗20～30次，静置4h后，将甲醇洗脱液接下，用旋转蒸发仪进行将甲醇蒸干，得到粗提物的浸膏。

5.根据权利要求1或4所述的抗植物病毒嘧肽霉素的制备工艺，其特征在于：将粗提物的浸膏用甲醇溶解，并加入等量的蒸馏水，置于分液漏斗中，然后加入二氯甲烷萃取，V甲醇：V蒸馏水：V二氯甲烷＝(1-3)：(1-3)：(2-5)；待完全萃取后，将二氯甲烷相接下，用旋转蒸发仪进行旋转蒸发，得到二氯甲烷萃取物。

6.根据权利要求1所述的抗植物病毒嘧肽霉素的制备工艺，其特征在于：将获得的粗提物进行硅胶柱层析，采用甲醇和二氯甲烷体系作为洗脱剂进行分离；采用梯度洗脱法洗脱，根据极性由低到高加入配好的洗脱剂，每一个洗脱剂洗脱量为400mL；

然后收集洗脱液，每个浓度梯度洗脱剂共收集若不同样品；然后，分别将每管样品用旋转蒸发仪浓缩，浓缩后将洗脱液转移至试管中，并依次编号。