[发明专利]产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌及其应用

说明书

本发明涉及一种酰胺酶类溶菌酶、所述酰胺酶类溶菌酶的表达载体以及表达系统，尤其涉及产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌及其应用。采用本发明提供的蓝藻工程菌表达并纯化得到酰胺酶类溶菌酶，具有较高的抑菌活性以及酶解肽聚糖的活性，具有重要的医用抗菌、食品防腐、科研工具酶等价值。

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程技术领域，具体涉及一种产酰胺酶类溶菌酶的蓝藻工程菌及其应用。

背景技术

溶菌酶(Lysozyme)是一类专门水解细菌细胞壁上黏多糖糖苷键的碱性酶。溶菌酶广泛存在于卵清、唾液、生物液体中，动物组织、植物组织、微生物中也有溶菌酶的存在。医用溶菌酶具有抗菌和抗病毒功效，适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。又由于溶菌酶的无毒、无副作用，其还可以作为天然的食品防腐剂，现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐。还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增值。此外，溶菌酶处理细菌还可以协助得到原生质体，因此溶菌酶还是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。

蛋清溶菌酶有限的抑菌谱限制了其进一步应用，高提取率和更广泛抑菌谱的微生物溶菌酶正日益受到研究人员重视。但该酶主要溶解革兰氏阳性菌，因而限制了它的进一步应用，且国内蛋清溶菌酶年产量不足50顿，特别是高活性的溶菌酶供应还不能满足日益增长的需求。微生物溶菌酶的研究和应用虽然尚处于起步阶段，但因其较高的提取率、广泛的溶菌谱和优越的抑菌性，正日益受到研究人员的重视。微生物产溶菌酶主要有3种:N－乙酰己糖胺酶、酰胺酶、内肽酶。

酰胺酶(N-acetylmuramoyl-L-alanineamidase)是一类作用于肽聚糖酰胺键的溶菌酶，它可以切断细菌肽聚糖中NAM上乳酸的羧基与肽尾丙氨酸之间的N-乙酰-L-丙氨酸酰胺键。酰胺酶广泛存在于细菌中，但是只有在少数菌株中才检测出活性高的溶菌酶。噬菌体T7溶菌酶就是一种N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，体外重组表达T7溶菌酶对细菌的肽聚糖有着明显的降解活性，但Zn²⁺是其酰胺酶活性所必需的。除此之外，鲜有其它种类的具有高效溶菌活性的酰胺酶被报道发现。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种酰胺酶类溶菌酶，是目前除噬菌体T7溶菌酶外少数同样属于酰胺酶类溶菌酶的一种，具有重要的医用抗菌、食品防腐、科研工具酶的价值。

具体而言，本发明提供的酰胺酶类溶菌酶，具有SEQ1所示的氨基酸序列，或与其相似度为90％以上的氨基酸序列。

本发明提供的酰胺酶类溶菌酶具有高效裂解革兰氏阴性菌(大肠杆菌等)的细胞壁功能，具有高效抑菌活性。

本发明的第二目的是提供编码所述酰胺酶类溶菌酶的基因序列。

作为本发明的一种优选方案，本发明提供的编码酰胺酶类溶菌酶的基因序列，具有SEQ2所示的序列。

作为本发明的一种优选方案，所述基因序列的N端带有His标签，优选为6～10个His标签，以便于表达后纯化。

本发明的第三目的是提供一种酰胺酶类溶菌酶的表达载体，其包含本发明所述的基因序列。

作为本发明的一种优选方案，所述表达载体为蓝藻表达载体。

作为本发明的一种优选方案，所述表达载体为蓝藻穿梭载体pAQE19。所述蓝藻穿梭载体pAQE19的相关信息，可参见文献Dongyi Xu 2005；Plant Physiology,July 2005,Vol.138,pp.1586–1595。采用该表达载体，可以实现本发明所述酰胺酶类溶菌酶的高效表达。