[发明专利]一种基于CRISPR-Cas9技术设计点突变模型的方法及系统

权利要求书

1.一种基于CRISPR-Cas9技术设计点突变模型的方法，包括如下步骤：

确定点突变模型动物的突变位点；

根据突变信息计算突变点所在目标外显子或者突变位点最临近的外显子的编码范围；

gRNA设计：在突变点上下游50bp范围内设计gRNA，计算并基于gRNA的脱靶分值、gRNA切割位置与突变点的相对位置分值、gRNA回切分值确定不同gRNA序列组合总分值，基于总分值确定候选gRNA序列组合；

输出设计方案；

其中，所述脱靶分值的计算方法为：脱靶分值设为0或1，脱靶序列与gRNA之间存在低于或者等于1个碱基错配数时，分值为0；其他情况下，脱靶分值为1；

所述相对位置分值的计算方法为：

等级1：gRNA为正向，gRNA右侧末端碱基在突变点左侧7到右侧10范围内，距离点突变越远越优；

等级2：gRNA为反向，gRNA左侧末端碱基在突变点左侧7到右侧10范围内，距离点突变越远越优；

等级3：gRNA为正向，gRNA右侧末端碱基在突变点右侧11-30范围内，距离点突变越近越优；

等级4：gRNA为反向，gRNA左侧末端碱基在突变点左侧8-30范围内，距离点突变越近越优；

等级5：gRNA为反向，gRNA左侧末端碱基在突变点右侧11-35范围内，距离点突变越近越优；

同等条件下，选择靠前等级的gRNA，同等级的gRNA选择距离更优的；

所述gRNA回切分值的计算方法为：

根据目标序列与gRNA序列的错配碱基数量及位置确定，包括：

a.错配碱基位于gRNA序列最后两个碱基，一个碱基110分，但不能是AG或GA，否则无分；

b.错配碱基位于gRNA的第1-7位，一个碱基20分；

c.错配碱基位于gRNA的第8-13位，一个碱基50分；

d.错配碱基位于gRNA的第14-20位，一个碱基100分；

所述gRNA序列组合 总分值的计算方法为：

a.满足脱靶筛选，脱靶分值=1；

b.满足破坏回切设定，gRNA回切分值累计高于或者等于100分；

c.同义突变氨基酸数；

i.0个氨基酸同义突变；

ii.1-2个氨基酸同义突变；

iii.3-4个氨基酸同义突变；

d.gRNA切割位置与突变点的相对位置分值按等级排序。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述点突变模型动物的突变位点基于不同物种的已知同源突变位点确定，其方法包括：

通过BLAST已知物种突变位点的蛋白序列和模型动物的同源基因蛋白序列，处理氨基酸突变、碱基插入和碱基删除的数据，得到模型动物的mRNA序列；

将所述模型动物的mRNA序列转换对应于模型动物基因序列，得到所述点突变模型动物的突变位点。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述gRNA设计中，通过在gRNA中引入同义突变增加gRNA序列与目标序列的错配碱基，从而降低gRNA回切概率。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述模型动物为鼠、兔子、猪、狗、灵长类、果蝇。

5.一种基于CRISPR-Cas9技术设计点突变模型的系统，包括：

突变位点确定模块：用于确定或设计点突变模型动物的突变位点；

gRNA设计模块：用于在突变点上下游50bp范围内设计gRNA，计算并基于gRNA的脱靶分值、gRNA切割位置与突变点的相对位置分值、gRNA回切分值确定不同gRNA序列组合总分值，基于总分值确定候选gRNA序列组合；以及

方案输出模块：用于输出设计得到的点突变构建方案；

其中，所述脱靶分值的计算方法为：脱靶分值设为0或1，脱靶序列与gRNA之间存在低于或者等于1个碱基错配数时，分值为0；其他情况下，脱靶分值为1；

所述相对位置分值的计算方法为：

等级1：gRNA为正向，gRNA右侧末端碱基在突变点左侧7到右侧10范围内，距离点突变越远越优；

等级2：gRNA为反向，gRNA左侧末端碱基在突变点左侧7到右侧10范围内，距离点突变越远越优；

等级3：gRNA为正向，gRNA右侧末端碱基在突变点右侧11-30范围内，距离点突变越近越优；

等级4：gRNA为反向，gRNA左侧末端碱基在突变点左侧8-30范围内，距离点突变越近越优；

等级5：gRNA为反向，gRNA左侧末端碱基在突变点右侧11-35范围内，距离点突变越近越优；

同等条件下，选择等级靠前的gRNA，同一等级选择距离优的；

所述gRNA回切分值的计算方法为：

根据目标序列与gRNA序列的错配碱基数量及位置确定，包括：

a.错配碱基位于gRNA序列最后两个碱基，一个碱基110分，但不能变成AG或GA，否则无分；

b.错配碱基位于gRNA的第1-7位，一个碱基20分；

c.错配碱基位于gRNA的第8-13位，一个碱基50分；

d.错配碱基位于gRNA的第14-20位，一个碱基100分；

所述gRNA序列组合 总分值的计算方法为：

a.满足脱靶筛选，脱靶分值=1；

b.满足破坏回切设定，gRNA回切分值累计高于或者等于100分；

c.同义突变氨基酸数；

i.0个氨基酸同义突变；

ii.1-2个氨基酸同义突变；

iii.3-4个氨基酸同义突变；

d.gRNA切割位置与突变点的相对位置分值按等级排序。