[发明专利]一种培养间充质干细胞提取外泌体的方法、外泌体冻干剂及制备方法

说明书

本发明公开了一种培养间充质干细胞提取外泌体的方法、外泌体冻干剂及制备方法，包括：对组织块进行平皿贴壁培养，所得间充质干细胞制备成间充质干细胞悬液；将间充质干细胞悬液导入中空纤维培养装置中进行中空纤维培养，收集中空纤维培养装置外空间培养上清液；对培养上清液进行离心、过滤，提取外泌体。将提取的外泌体与氯化钠、普鲁兰、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、葡萄糖、乳酸钠、氯化钾、白蛋白、丝蛋白和华通氏胶，制成外泌体冻干剂。本发明的中空纤维培养法培养细胞模拟细胞体内生长环境，实现了细胞与细胞之间相互作用，互相刺激，所得外泌体的种类更多、浓度更高、外泌体提取量更大、操作更方便，满足表皮细胞所需的营养物质。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种培养间充质干细胞提取外泌体的方法、外泌体冻干剂及制备方法，具体涉及一种基于中空纤维培养法培养间充质干细胞提取外泌体的方法，以及基于外泌体所制备的外泌体冻干剂，以及该外泌体冻干剂的制备方法。

背景技术

目前细胞培养方法主要以平面培养为主，传统的细胞平面培养法培养细胞，细胞的生长方式与机体内的立体环境差别很大，导致细胞形态、分化、细胞与基质间的相互作用以及细胞间的相互作用与体内生理条件下细胞的行为存在显著差异，细胞平面培养法培养细胞诸多生理指标显著不同。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种培养间充质干细胞提取外泌体的方法、外泌体冻干剂及制备方法。

本发明第一目的提供一种培养间充质干细胞提取外泌体的方法，包括：

对组织块进行平皿贴壁培养，所得间充质干细胞制备成间充质干细胞悬液；

将所述间充质干细胞悬液导入中空纤维培养装置中进行中空纤维培养，收集所述中空纤维培养装置外空间培养上清液；

对所述培养上清液进行离心、过滤，提取外泌体。

作为本发明的进一步改进，所述组织块的来源为脐带。

作为本发明的进一步改进，所述对组织块进行平皿贴壁培养，所得间充质干细胞制备成间充质干细胞悬液；包括：

组织块用0.125％-0.25％胰酶消化8min-15min，离心300g-450g、5min-10min，离心完毕后去掉上清液，留下组织；

将组织分成1mm-5mm大小的组织块进行平皿贴壁，将平皿倒置搁放37℃、CO₂培养箱20min-30min，每皿加入3ml-5ml DMEM培养基培养；

连续培养每隔1天半量换液，收集培养液，待细胞贴壁，去除组织块，收集培养液；

每皿待贴壁细胞生长至融合度80％以上，收集培养液，用PBS缓冲液清洗，0.125％-0.25％胰酶消化，去除胰酶，将细胞传至培养瓶中继续传代培养，细胞传代扩增至2代之后，收集培养液，用PBS清洗，0.125％-0.25％胰酶消化，去除胰酶，制备成含DMEM培养基的间充质干细胞悬液。

作为本发明的进一步改进，所述中空纤维培养的方法为：

将所述间充质干细胞悬液导入中空纤维培养装置中培养，每2-5天收集培养上清液，并更换新鲜的培养基；

培养至28-35天后终止培养，连续培养过程中收集中空纤维培养装置外空间培养上清液。

作为本发明的进一步改进，所述中空纤维培养的具体方法为：