[发明专利]荧光定量PCR检测十足目虹彩病毒1的引物组及试剂盒

说明书

本发明公开了荧光定量PCR检测十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1，DIV1)的引物组及试剂盒，属于病毒检测技术领域。具体包括检测十足目虹彩病毒1的引物和TaqMan‑MGB探针，以及基于上述检测引物和探针的试剂盒。本发明根据DIV1的MCP基因保守序列设计特异性的引物及TaqMan‑MGB探针，制备了重组质粒标准品pMD18‑T‑MCP^DIV1，建立检测DIV1的TaqMan‑MGB探针荧光定量PCR方法，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量范围宽、简单快速等优点；并研发了相应的检测试剂盒便于推广应用，有利于DIV1的快速定量检测及相关疾病的防控。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，更具体地说是涉及荧光定量PCR检测十足目虹彩病毒1的引物组及试剂盒。

背景技术

十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1，DIV1)是近年新发现并鉴定的一种新型虹彩病毒，DIV1可感染凡纳滨对虾、罗氏沼虾、红螯螯虾、中国对虾等多种经济养殖虾类并可引起大规模死亡，也可感染浮游生物、河虾、鲫、螺蛳以及河蟹等常见水生生物成为传染源传播病毒；DIV1具多种易感宿主的特性使其更易于传播流行，已引起我国多个地区的养殖虾类暴发疫病大批死亡，成为中国养虾业面临的新威胁。

目前针对病毒病尚无有效的治疗方法，避免与病毒的接触是最有效的预防措施，而这又主要依赖于病毒传染源的快速检测。

但是，目前国际和国内均没有发布DIV1检测的相关标准，而农业农村部在DIV1监测计划中推荐采用套式PCR法进行检测；但在实际检测工作中，套式PCR法虽敏感性高，但需两轮PCR及电泳，操作繁琐，检测时间长且多次开盖容易交叉污染，特别在PCR分区条件不好的实验室容易形成气溶胶污染环境而出现假阳性。

此外，DIV1快速检测方法还有TaqMan探针定量PCR法和环介导恒温扩增技术(LAMP)，但TaqMan探针定量PCR由于探针长度太长，敏感性不够理想；LAMP灵敏、快速，但在实验室条件下容易出现假阳性。

因此，如何克服现有DIV1检测方法的不足，快速、高效、准确地检测DIV1，为亲虾筛选、虾苗检疫、疫情监测等提供重要的技术支持，为更好地预防和控制由DIV1引起的虾病害是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了荧光定量PCR检测十足目虹彩病毒1的引物组及试剂盒。TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法既能发挥荧光定量PCR法的优势而克服套式PCR法的缺点，且其探针连接MGB基团相对于TaqMan探针因长度缩短易于与模板退火而更有利于提高方法的灵敏度，非常适用于对灵敏度要求高的病原体定量检测，可提高DIV1检测的效率和敏感性。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种荧光定量PCR检测十足目虹彩病毒1的引物组，包括上游引物DIV1-qF1、下游引物DIV1-qR1和TaqMan-MGB探针DIV1-qP1，序列如下：

DIV1-qF1：5’-CGGTGTCAGGAACACTACC-3’，SEQ ID No.1；

DIV1-qR1：5’-CAGTCATCACGGGAATACGAT-3’，SEQ ID No.2；

DIV1-qP1：5’-FAM-CCATAGGCACCGCAAA-MGB-3’，SEQ ID No.3；

其中，DIV1-qP1的5′端标记荧光染料FAM、3′端标记MGB基团。

根据虹彩病毒MCP基因保守性高的特点及TaqMan-MGB探针的优势，在DIV1的MCP基因保守序列设计了特异性的引物及TaqMan-MGB探针；