[发明专利]一种多重PCR_SNP基因分型检测方法

权利要求书

1.一种多重PCR_SNP基因分型检测方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型检测方法PCR扩增时，引物的3`端碱基跟模板完全匹配时，DNA聚合酶进行延伸反应，检测信号就强；如果引物的3`端碱基跟模板不匹配，检测信号就弱；根据等位基因的基因型的不同设计不同的引物，将不同的等位基因区分开，在不同等位基因的引物5端各自连上一段不同的tag序列，序列能与芯片上点制的tag序列杂交，实现对基因型的判读。

2.如权利要求1所述的多重PCR_SNP基因分型检测方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型检测方法的四个SNP位点设计引物，并在上游引物的5`端分别连接Tag1/Tag2、Tag3/Tag4、Tag5/Tag6、Tag7/Tag8，同时用这四对Tag点制芯片，每个Tag重复点3个点，同时点上杂交阳性质控点PC 3个，杂交阴性质控点NC 3个，Blank点3个，Hex点3个。

3.如权利要求1所述的多重PCR_SNP基因分型检测方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型检测方法包括设计待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物。

4.如权利要求3所述的多重PCR_SNP基因分型检测方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型检测方法包括提取血样中的DNA，用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，质检合格的DNA将浓度调整到50ηg/ul，-20℃储存备用。

5.如权利要求4所述的多重PCR_SNP基因分型检测方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型检测方法包括PCR扩增，采用多重PCR扩增技术，每个反应总体积5ul，包含模板DNA10ηg，HotstarTaq 0.5U，扩增引物每条0.5pmol，25mM dNTP，0.1ul，反应条件为94℃4分钟；94℃20秒，56℃30秒，72℃1分钟，45个循环；72℃3分钟；4℃。

6.如权利要求5所述的多重PCR_SNP基因分型检测方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型检测方法包括PCR产物纯化，PCR反应产物使用0.5U SAP处理，去除体系中游离的dNTP，反应体系7μl，其中PCR产物5μl，SAP混合液2μl，SAP 0.5U,buffer 0.17μl，反应程序37℃20分钟；85℃5分钟；4℃。

7.如权利要求6所述的多重PCR_SNP基因分型检测方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型检测方法包括单碱基延伸，总体积9μl反应体系包含SAP处理后PCR产物7μl，其中各延伸反应引物混合物0.804l,iPLEX酶0.041l,延伸混合物0.2μl，反应程序为94℃30秒；94℃5秒；52℃5秒，80℃5秒5个循环；返回94℃5秒，共40个循环；72℃3分钟，4℃。

8.如权利要求7所述的多重PCR_SNP基因分型检测方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型检测方法包括树脂纯化，每个延伸反应产物用6mg Clean Resin树脂纯化；

芯片点样及质谱检测，将纯化产物移至384孔SpectroCHIP芯片上，上机测定，SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析，检测结果使用软件分型并输出结果。

9.如权利要求8所述的多重PCR_SNP基因分型检测方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型检测方法包括：

(1)数据预处理，过滤掉在所有样品中无信息量的位点及分型成功率小于90％的位点；过滤掉在对照样品中MAF小于0.01的位点；用对照样品，对每个SNP位点进行哈迪-温伯格平衡检验；

(2)单点关联分析方法，针对预处理后的每个位点，用卡方检验和Fisher精确检验方法对四种情况检验病例和对照间的差异，并对能计算比值比的情况，计算比值比及其95％置信区间。

10.如权利要求9所述的多重PCR_SNP基因分型检测方法，其特征在于，所述多重PCR_SNP基因分型检测方法包括四种情况：

(1)对等位基因频率进行卡方检验和Fisher精确检验并计算OR值及95％置信区间；

(2)对基因型频率进行卡方检验和Fisher精确检验；

(3)针对显性模型对基因型频率进行卡方检验和Fisher精确检验并计算OR值及95％置信区间；

(4)针对隐性模型对基因型频率进行卡方检验和Fisher精确检验并计算OR值及95％置信区间。