[发明专利]构建包含大片段反向互补序列载体的方法

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种构建包含大片段反向互补序列载体的方法：把包含大片段反向互补的目标序列分成两个无反向互补序列的片段(片段1和片段2)，基因合成这两个片段，在每个片段的两端加上TypeIIS酶切位点；经过酶切后片段1和片段2及目标载体间能够产生互补的粘性末端，经连接和转化可得到包含大片段反向互补序列的阳性克隆。此方法能够有效解决包含大片段反向互补序列载体构建的难题，具有重要意义。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种构建包含大片段反向互补序列载体的方法。

背景技术

普通分子生物学实验中经常涉及构建DNA质粒载体，在构建质粒载体过程中，经常遇到目标DNA片段包含大片段的反向互补序列(如构建长双链RNA前体载体)(100bp)，反向互补序列可以形成发夹结构，从而增加载体构建的难度。当前基因合成是构建DNA载体的重要途经之一，如果需要合成的DNA中包含大片段反向互补序列，进行基因合成难度大，不可行。构建这类载体，通常会采用普通的酶切/连接的方法，先将一个片段放入载体中，再将第二个片段(与已插入的片段形成反向互补结构)插入质粒载体中。但是，这个方法耗时费力，成功率极低，经常出现插入第二个片段后没有阳性克隆生长的情况。另一方面，采用同源重组的方法，因为反向同源序列的存在影响同源重组的过程。因此，如何快速构建包含大片段反向互补序列的载体，是分子生物学操作中经常遇到的难题。

References

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发明内容

本发明提供一种快速构建包含大片段反向互补序列载体的方法，能够有效解决构建包含大片段反向互补序列载体的难题，具有重要意义。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种构建包含大片段反向互补序列的方法，其中反向互补序列跨度大于或等于100bp，反向互补序列同源性大于或等于50％，该方法包括以下步骤：

S1：序列分割：把目标序列分解成两个无反向互补序列的片段：片段1，片段2，在每个片段的两端均设计为包含Type IIS酶切位点；基因合成这两个片段。

S2：酶切/连接反应：将片段1和片段2和/或克隆载体用type IIS内切酶进行酶切/连接反应，经酶切后，片段1，片段2和克隆载体能够产生互补的粘性末端，连接反应后片段1，片段2和克隆载体通过粘性末端结合在一起，获得连接产物。

进一步地，上述酶切和连接反应在同一反应体系中进行。

进一步地，上述步骤S2中还包括加热使酶失活的步骤。

进一步地，上述步骤S1中分解成两个无反向互补序列的片段中，分解位点位于两个反向互补序列之间任何两个相邻碱基位点之间。

进一步地，上述酶切反应温度为25℃-58℃，连接反应温度为4℃-24℃。

进一步地，本发明的方法还包括：