[发明专利]一种脂肪源性干细胞的培养方法

说明书

本发明涉及生物干细胞培养技术领域，特别是涉及一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括：将脂肪块与消化液震荡消化，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中密封离心，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液；滴加培养基使得培养瓶的顶部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部接触，将培养瓶翻转180°，使得脂肪源性干细胞悬液铺到培养瓶的底面，恒温培养，即可。本发明解决了现有技术中组织贴壁法中由于脂肪油滴阻碍细胞贴壁从而导致细胞贴壁率低和细胞提取效率低的问题，利用培养瓶亲油的特性，通过预先在顶部吸附脂肪油滴，提高细胞贴壁率和细胞提取效率。

技术领域

本发明涉及生物干细胞培养技术领域，特别是涉及一种脂肪源性干细胞的培养方法。

背景技术

脂肪源性干细胞(adiposetissue-derived stem cells，ADSCs)，是一类可以自我更新、繁殖的干细胞，具有一般干细胞的多向分化潜能和稳定的体外多代增殖能力。不仅能在不同诱导因子的作用下分化成为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、神经细胞等，而且还能分泌大量的、多类型的细胞因子及促进血管生成因子和凋亡因子，并能通过旁分泌作用于成纤维细胞促进其分泌I型胶原、III型胶原和纤连蛋白，促进胶原合成，可发挥抗炎、抗氧化、抗衰老、损伤修复等作用。此外脂肪组织储量丰富且获取简便，且无伦理争议，是组织工程研究中理想的种子细胞来源之一。

目前脂肪源干细胞的提取方式多采用机械法、酶消化和组织贴壁培养法。酶消化法和机械法的操作过程较繁琐；此外酶消化法消化时间长，消化后所得脂肪血管基质碎片，成分复杂。组织贴壁法操作步骤少，实验处理时间短，且不加入外源胶原酶、细胞因子等，成本较低，但在操作过程中脂肪油滴阻碍细胞贴壁，很难保证组织块全部贴壁，且换液时容易漂浮，细胞提取效率不高。此外平时使用的聚苯乙烯材料的无菌一次性培养瓶表面具有很强的亲油特性，用上述组织贴壁法提取脂肪源性干细胞，不可避免的会使得培养瓶底部沾染上消化出来的脂肪油滴，而沾染脂肪油滴的部位细胞就不能贴壁生长，因此培养瓶底部的“有效面积”大大减少，长出的细胞也会减少很多。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种脂肪源性干细胞的培养方法，解决了现有技术中组织贴壁法中由于脂肪油滴阻碍细胞贴壁从而导致细胞贴壁率低和细胞提取效率低的问题。本发明利用培养瓶亲油的特性，通过预先在顶部吸附脂肪油滴，从而避免培养瓶底面出现脂肪油滴，提高细胞贴壁率和细胞提取效率。

为实现上述目的及其他相关目的，

本发明提供一种脂肪源性干细胞的培养方法，包括如下步骤：

步骤一、将脂肪块与消化液按照体积比为2：(0.8～1.2)混合，在30～40℃下震荡消化10～90min，静置，吸取上层脂肪细胞液加入培养基中，密封后离心去除上清液，再加入培养基吹打细胞，即得脂肪源性干细胞悬液待用；

步骤二、滴加培养基使得培养瓶的顶部润湿，将脂肪源性干细胞悬液接种至已润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部接触，将培养瓶翻转180°，使得脂肪源性干细胞悬液铺到培养瓶的底面，在35～40℃下进行恒温培养，即可。

脂肪块与消化液混合后震荡消化，再将上层脂肪细胞液移入培养基中离心，再通过吹打即可制成脂肪源性干细胞悬液。将脂肪源性干细胞悬液接种在预先润湿的培养瓶的顶部，晃动培养瓶使得脂肪源性干细胞悬液与培养瓶的顶部充分接触，此时利用培养瓶亲油的特性，通过晃动的过程使得脂肪油滴吸附在培养瓶的顶部。通过180°旋转使得脂肪油滴依旧吸附在培养瓶的顶部，脂肪源性干细胞悬液可以铺到培养瓶的底面，从而避免培养瓶底面出现脂肪油滴，提高细胞贴壁率和细胞提取效率。

于本发明的一实施例中，所述步骤一中脂肪块与消化液的体积比为2：1。

于本发明的一实施例中，所述步骤一中消化液含有浓度为0.1～5mg/ml的I型胶原酶。