[发明专利]半胱天冬酶生物传感器及应用、半胱天冬酶活性的检测方法

权利要求书

1.一种半胱天冬酶生物传感器，其特征是，包括磁珠、检测探针、环形模板、DNA聚合酶、二级引物；所述磁珠表面包覆链霉亲和素；所述环形模板为环形单链DNA序列，所述二级引物为单链DNA序列；

所述检测探针包括连接的肽底物结构域和DNA引物结构域，所述肽底物结构域为氨基酸序列，所述DNA引物结构域为单链DNA序列；肽底物结构域含有特异位点，所述特异位点能够被半胱天冬酶识别并切割，所述特异位点与连接位点距离n个氨基酸，所述连接位点是肽底物结构域和DNA引物结构域的连接处，所述肽底物结构域连接生物素，特异位点位于生物素与连接位点之间，所述n为小于10的自然数；

所述DNA引物结构域能够与环形模板、DNA聚合酶、二级引物配合进行分支滚环扩增反应；

所述检测探针的序列为：Lys-Ser-His-Ser-His-Gly-Asp-Thr-Glu-Ile-Cys-CAT TCGGTA GTA GGT TGT ATA GTT G；

所述环形模板的序列为：CAA CTA TAC AAC CTA CTA CCG AAT GAA TAT GAA CAC ATTCTA AGT CTC TAT GTC TGG CAA CAG TGT；

所述二级引物的序列为：CAT TCT AAG TCT CTA TGT CTG；

所述半胱天冬酶为半胱天冬酶-8。

2.如权利要求1所述的半胱天冬酶生物传感器，其特征是，所述特异位点为天冬氨酸和甘氨酸之间的肽键。

3.如权利要求1所述的半胱天冬酶生物传感器，其特征是，n为5。

4.如权利要求1所述的半胱天冬酶生物传感器，其特征是，DNA聚合酶为phi29 DNA聚合酶。

5.一种权利要求1~4任一所述的半胱天冬酶生物传感器在制备检测半胱天冬酶-8活性药剂中的应用。

6.一种检测半胱天冬酶活性的试剂盒，其特征是，包括权利要求1~4任一所述的半胱天冬酶生物传感器、缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸。

7.一种半胱天冬酶-8活性的检测方法，其特征是，提供权利要求1~4任一所述的半胱天冬酶生物传感器或权利要求6所述的试剂盒，通过链霉亲和素和生物素的相互作用使检测探针与磁珠连接，半胱天冬酶识别检测探针的特异位点并切割，释放DNA引物结构域，释放的DNA引物结构域与环形模板、DNA聚合酶、二级引物进行分支滚环扩增反应，然后添加荧光染料进行荧光检测；

所述的半胱天冬酶活性的检测方法以非疾病的诊断与治疗为目的。

8.如权利要求7所述的半胱天冬酶-8活性的检测方法，其特征是，将磁珠与检测探针在室温下进行第一次孵育，然后洗涤去除未与磁珠连接的检测探针。

9.如权利要求7所述的半胱天冬酶-8活性的检测方法，其特征是，荧光检测的激发波长为495nm。

10.如权利要求7所述的半胱天冬酶-8活性的检测方法，其特征是，将半胱天冬酶添加至检测溶液中，所述检测溶液中含有连接检测探针的磁珠，在人体温度下进行第二次孵育，将孵育后中磁珠分离去除，获得清液，向清液中添加环形模板、二级引物、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸进行第三次孵育，再向第三次孵育后的产物添加荧光染料，然后进行荧光检测；

第二次孵育的时间25~35min；

向清液中添加环形模板、二级引物加热至90~100℃处理，冷却后加入DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸进行第三次孵育；

第三次孵育的温度为25~35℃，孵育时间为55~65min；

第三次孵育后在64~66℃的温度条件下处理。

11.一种权利要求1~4任一所述的半胱天冬酶生物传感器或权利要求6所述的检测半胱天冬酶活性的试剂盒在筛选半胱天冬酶-8抑制剂中的应用。

12.一种权利要求1~4任一所述的半胱天冬酶生物传感器在制备内源性半胱天冬酶-8蛋白酶活性检测药剂中的应用，所述特异位点能够被内源性半胱天冬酶-8蛋白酶识别并切割。