[发明专利]一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针及其制备方法

权利要求书

1.一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针，其特征在于，所述多肽拉曼探针的结构为Cys-Linker-X-Ag纳米粒子-Z；所述X为胶原蛋白靶向多肽(Gly-Pro-Hyp)₇或LRELHLNNNG；所述Linker为6-氨基己酸、聚乙二醇、1-10个甘氨酸、聚乙烯中的至少一种；所述Z为拉曼信号分子4-MBA、4-MBN、4-EBT、4-三甲基硅基乙炔-苯硫酚、4-苯基乙炔基-苯硫酚、硫代乙酸S-(4-三甲基硅烷基乙炔基-苯基)酯中的至少一种。

2.一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的制备方法，其特征在于，为以下步骤：1)固相合成特定序列的胶原蛋白靶向多肽；2)将信号分子修饰到具有拉曼增强能力的Ag纳米粒子上；3)将多肽结合到已被信号分子修饰的Ag纳米粒子上；所述信号分子为4-MBA、4-MBN、4-EBT、4-三甲基硅基乙炔-苯硫酚、4-苯基乙炔基-苯硫酚、硫代乙酸S-(4-三甲基硅烷基乙炔基-苯基)酯中的至少一种；所述胶原蛋白靶向多肽的序列为：Cys-Linker-X，所述X为胶原蛋白靶向多肽(Gly-Pro-Hyp)₇或LRELHLNNNG；所述Linker为6-氨基己酸、聚乙二醇、1-10个甘氨酸、聚乙烯中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的制备方法，其特征在于，固相合成特定序列的胶原蛋白靶向多肽的方法为：

a)将80-120mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；

b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；

c)将N端由Fmoc保护的氨基酸与HOBt和HBTU由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs，氨基酸、HOBt、HBTU与DIEA的摩尔比为4:4：4:6；

d)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mLDMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mL的DMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；

e)之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的胶原多肽后，显色反应检测反应完全后，树脂分别由3-8mLDMF和DCM洗2-4次；

f)树脂分别用DCM和甲醇轮流洗涤2-4次，然后将树脂抽干，加入切割液，切割液的组分为TFA:TIS:水的质量比为90:5:5，反应1-6hrs；

g)向反应液加入冰乙醚中，将多肽沉淀，然后通过离心收集沉淀，用TFA溶解沉淀，加入过量冰乙醚再次沉淀并离心收集沉淀，沉淀用冰乙醚洗涤2-4次后干燥，得到粗肽，粗肽由反相液相色谱纯化得纯肽。

4. 根据权利要求3所述的一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的制备方法，其特征在于，将信号分子修饰到具有拉曼增强能力的Ag纳米粒子上的具体方法为，该信号分子通过巯基或氨基修饰到纳米粒子表面，首先将信号分子溶于DMSO配成100mM的溶液，取1mL Ag纳米粒子与100μL信号分子溶液混合搅拌1-4hrs，使巯基配位到纳米粒子表面，然后12000rmp离心洗去多余信号分子，得到信号分子修饰的Ag纳米粒子。

5.根据权利要求3所述的一种靶向识别胶原蛋白的多肽拉曼探针的制备方法，其特征在于，将多肽结合到已被信号分子修饰的Ag纳米粒子上的具体方法为：多肽通过N-端的半胱氨酸配位作用修饰到纳米粒子上，将多肽溶于水中配成2mM的溶液，取200μL修饰了信号分子的Ag纳米粒子与400μL多肽溶液混合搅拌1-4hrs，确保半胱氨酸上的巯基配位到纳米离子表面，保证了多肽的成功修饰，然后12000rmp离心洗去多余多肽，得到多肽修饰的拉曼探针。