[发明专利]HLA亚型检测试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及HLA亚型检测试剂盒，所述试剂盒包括用于检测多种HLA亚型的多重PCR扩增的引物和探针，每对HLA亚型上游和下游引物的量比值为1:20到1:50，每对引物上游引物的Tm值比下游引物的Tm值高4‑8℃。本发明结合通过提高限速引物的退火温度，加上调整上下游引物的配比，能较传统制备单链方法在不损失PCR扩增效率的情况下，制备出更多的单链，从而使得探针的杂交信号较传统的多重单链制备PCR得到明显的提升，从而提高了检测的灵敏度和特异性。

技术领域

本发明涉及分子诊断领域，特别涉及HLA亚型检测试剂盒及其应用。

背景技术

癫痫是神经科第二常见疾病，我国癫痫患者过千万，每年新增约40万，药物治疗为癫痫的主要治疗方式，多数患者需要长期服药，但大约16％的患者出现皮肤型过敏反应，包括轻度的斑丘疹(maculopapular exanthema,MPE)及重度的斯蒂文森-强生综合症(Stevens-Johnson syndrome，SJS)和中毒性表皮坏死松解症(toxic epidermalnecrolysis，TEN)，明显影响生活质量，严重时出现剥脱性皮炎，通常全身粘膜(眼、嘴、生殖器)溃疡，皮肤起水疱，甚至出现全身表皮脱离，如同大面积烫伤，致死性高达40％。这种过敏在南方汉族人群，尤其是在广东及周边地区的汉族人群中发病率明显高于其它地区及人群。

卡马西平(CBZ)、拉莫三嗪(LTG)、奥卡西平(OXC)、苯妥英钠(PHT)以及妥泰(PB)都具有相似的芳香族结构，是广泛使用的用于控制癫痫、三叉神经痛等的抗癫痫药物(AEDs)。然而，该类药物通常会导致皮肤不良反应(cADRs)，长期困扰着临床医生。cADRs占所有报道的药物不良反应的10％-30％，包括轻度的斑丘疹(MPE)、药物超敏反应综合症(HSS)到重型的有潜在致命性的Stevens-Johnson综合症(SJS)和/或中毒性表皮坏死松解症(Toxicepidermal necrolysis,TEN)。如能找到与其相关的基因标志，将对临床用药起到很大的指导作用。人类白细胞抗原(HLA)基因与人体免疫相关，包括数千个不同的基因型。HLA-B*15:02为我国南方汉族人群卡马西平导致剥脱性皮炎的遗传标记。HLA-A*24:02是卡马西平导致剥脱性皮炎的风险基因，也是其它抗癫痫药物导致剥脱性皮炎的通用风险基因，除了以上两个，并且还存在其它HLA风险基因，包括HLA-A*02:01、HLA-B*15:01、HLA-B*13:01、HLA-B*15:01、HLA-B*15:11、HLA-B*35:01、HLA-B*38:02和DRB1*04:06，这些基因型可以解释约90％的癫痫患者用药过敏风险。因此癫痫患者可通过基因筛查降低甚至避免致死性皮肤型不良反应的发生，例如由于HLA-B*15：02明确为卡马西平导致剥脱性皮炎的基因标记，2008年美国FDA已建议个体服用卡马西平前进行HLA-B*15:02基因检测，以避免剥脱性皮炎的发生。而HLA-A*24：02的发现，将卡马西平导致剥脱性皮炎的排除概率从69.6％提高到82％；这些癫痫药物的主要基因标记，将多个药物导致剥脱性皮炎的排除概率达到90％，而且为其他人种及其它类型的皮肤型过敏提供通用遗传标记，惠及的个体更多。个体特别是南方汉族人，服用芳香族抗癫痫药物之前，检测主要遗传标记，医生对携带主要遗传标记的阳性个体慎用芳香族类抗癫痫药物，降低甚至避免致死性皮肤型不良反应的发生。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种HLA亚型检测试剂盒，所述试剂盒包括用于检测多种HLA亚型的多重PCR扩增的引物和探针，每对HLA亚型的上游和下游引物的量比值为1:20到1:50，每对引物的上游引物的Tm值比下游引物的Tm值高4-8℃。

在一种实施方式中，每对HLA亚型的上游和下游引物的量比值为1:30到1:40。

在一种实施方式中，在所述上游引物5’端增加碱基GCG以提高所述上游引物的Tm值。