[发明专利]一种人工金属酶及其制备方法与应用

说明书

本申请属于蛋白质与生物技术领域，公开了一种人工金属酶及其制备方法与应用。本发明以肌红蛋白为蛋白质分子设计骨架，在活性中心血红素周围引入谷氨酸，加入Mg^II离子，形成金属离子‑蛋白质复合物Mg^II‑L29E Mb，构建了一种新型的人工金属酶。本发明所述Mg^II‑L29E Mb复合物能连续水解DNA分子中的磷酸二酯键，最终降解DNA分子，从而类似于天然核酸外切酶性质，具有DNA外切酶活性，能快速降解DNA分子，最终实现DNA完全降解。降解的DNA底物分子具有广谱性，包括线性DNA或环状DNA分子。而且，这一催化活性是野生型Mb或单独L29E Mb蛋白以及Mn^II(或Co^II)‑L29E Mb复合物所不具有的。

技术领域

本发明属于蛋白质与生物技术领域，具体涉及一种人工金属酶及其制备方法与应用，尤其是一种基于镁离子-肌红蛋白突变体复合物的人工金属酶及其制备方法与应用。

背景技术

蛋白质作为生命活动的物质基础，参与体内所有关键活动。据研究，约1/3蛋白质与特定金属离子结合来维持其结构和生物功能，这类蛋白称之为金属蛋白。在过去的几十年，基因工程和蛋白质工程技术的迅猛发展，血红素蛋白质的理性设计逐渐被人们所关注，蛋白质的理性设计有助于揭示血红素蛋白的结构和功能之间的关系。

肌红蛋白(Myoglobin，Mb)常作为血红素蛋白质分子设计骨架，它具有分子量小、稳定性高等特点，易获得高纯度蛋白和晶体结构等。以Mb为模板，通过设计调控血红素活性中心微环境，可设计获得各种人工金属蛋白酶。

基于基因工程和蛋白质工程技术的发展，运用定点突变技术可以研究特定氨基酸残基在蛋白质结构、功能和性质中的作用。

金属酶的活性部位一般都含有两个或多个协同作用的金属离子，这些金属蛋白的金属中心一般都具有独特的配位方式和配位集合结构，而正是由于配位后的这种特殊的结构和排列，使金属蛋白和金属酶具有特殊的功能和活化中心。天然金属酶的高催化活性，归因于其活性中心金属离子与周边的氨基酸残基的协同作用。因此，模拟天然金属蛋白和金属酶中的多核活性中心结构，能够合成具有降解核酸功能的人工金属水解酶。

申请人前期申请的申请号为201810251841.8.，发明名称为一种基于金属离子-肌红蛋白突变体复合物的人工金属水解酶的制备及应用的中国专利中，专利提到了锰离子Mn(^II)和钴离子(^II)与L29E Mb形成的Mn^II(或Co^II)-L29E Mb复合物。但该两种复合物只具有DNA内切酶活性，不具有外切酶活性，即只能将DNA切割成线状和开环缺口状态，而不能降解DNA。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题，提供一种具有外切酶活性，能快速降解线性或环状DNA分子的人工金属酶。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种人工金属酶，包括肌红蛋白突变体和金属离子，所述肌红蛋白突变体为L29EMb氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述金属离子为Mg^II。

本发明所述肌红蛋白突变体是在野生型肌红蛋白(Mb)的氨基酸序列中，第29位氨基酸由异亮氨酸(L)突变为谷氨酸(E)得到突变体蛋白L29E Mb，其氨基酸序列为：VLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDIEIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASEDLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRHPGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG。