[发明专利]一种肿瘤干性细胞的检测方法及其用途

权利要求书

1.一种肿瘤干性细胞检测方法，其特征在于，应用原始生殖细胞(Primordial germcells,PGCs)特异性标志物从体液、肿瘤组织或培养的肿瘤细胞中富集、捕获、分选、检测其中的肿瘤干性细胞-PGC样肿瘤细胞(PGC-like tumor cells)，其包括：

S1.单独或任意组合联合使用检测PGC样肿瘤细胞的基因/蛋白，包括：Octamer-binding transcription factor 4(Oct4),Sox2,Nanog,Stellar/Stella,Nanos Homolog3(NANOS3),Stage-specific embryonic antigen-1(SSEA1),Fragilis(also known asmouse interferon-induced protein like gene-1,mil-1/interferon-inducedtransmembrane protein 3,Ifitm3),c-Kit,Synaptonemal complex protein 3(Scp3),Synaptonemal complex protein 1(Scp1),PRDM14,Deleted in azoospermia-like(DAZL),Mvh(also known as Vasa),Alkaline phosphatase(AP)基因表达产物/蛋白；

S2.检测上述蛋白质和/或基因表达产物—RNA；

S3.使用上述抗体富集、捕获、分选、检测体液、肿瘤组织或肿瘤细胞培养物中的PGC样肿瘤细胞；其中，使用上述一种或一种以上基因的蛋白产物的抗体，单独或任意联合富集、捕获、分选、检测PGC样肿瘤细胞；

S4.使用上述抗体单独或任意联合用于Westernblot、免疫组化或免疫荧光检测肿瘤组织、肿瘤培养物中的上述蛋白的表达，确定PGC样肿瘤细胞；

S5.RT-PCR检测单个或任意组合的上述基因的RNA产物在体液、肿瘤组织、肿瘤细胞培养物中的表达；

S6.体液、肿瘤组织或肿瘤细胞培养物中的PGC样肿瘤细胞含量或其相关基因的表达检测，作为肿瘤肿瘤分级、预后判断和疗效的评估的指标。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的恶性肿瘤为广谱肿瘤，包括：肺癌、肝癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、皮肤癌、淋巴瘤、白血病、肾癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、神经系统肿瘤。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体液包括血液、尿液、胸腔积液、腹腔积液、脑脊液、消化液、精液、肿瘤穿刺液、淋巴液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血液包括全血、血清、血浆、分离有核细胞、血液中的循环肿瘤细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的AP的检测包括免疫组化、免疫荧光以及直接的AP化学法染色检测PGC样肿瘤细胞的存在。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于上述特异性蛋白分选出来的肿瘤干性细胞，进一步联合RT-PCR检测上述一种或二种及以上任意组合的基因，以提高检测的灵敏度和特异性。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的RT-PCR检测所述基因的RNA产物，逆转录后，所述的PCR包括：普通PCR、荧光定量PCR、巢式PCR、多重PCR或数字PCR。

8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述基因RT-PCR检测的样品包括经过其他任何方法富集、纯化、分选出的肿瘤细胞；如微流控、单细胞、其他标志物流式分选方法。

9.权利要求1所述的方法在用于肿瘤的恶性分级、复发预测、转移预测和疗效评估中的用途，其中，所述的方法结合流式细胞术、芯片、微流控、磁珠技术用于体液中循环肿瘤细胞、肿瘤组织、体外培养的肿瘤细胞的富集、捕获、检测其中的PGC样肿瘤细胞亚群。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，其中，所述的单个或多重抗体单独或任意联合富集、捕获、分选、检测肿瘤干性细胞；对多重抗体的使用中，使用同一荧光FITC标记SSEA1、IFITM3、Stellar抗体，然后用流式或者磁珠捕获或检测FITC阳性的细胞，得到SSEA+、IFITM3+或Stellar+的细胞(任意一个抗体阳性)，利用不同的荧光分别标记SSEA1、IFITM3、Stellar，检测SSEA+、IFITM3+和Stellar+同时阳性的细胞；提高PGC样肿瘤细胞亚群的灵敏度。