[发明专利]一种调控集胞藻中不饱和脂肪酸合成的方法及其应用

权利要求书

1.敲除spkD基因在降低蓝藻中多不饱和脂肪酸合成中的应用，所述spkD基因核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述spkD基因作为调控亚油酸、γ-亚麻酸、α-亚麻酸和十八碳四烯酸表达量的基因。

3.一种降低集胞藻中多不饱和脂肪酸合成的方法I，其特征在于，包括步骤如下：

（1）用引物对spkD-F，spkD-R对集胞藻PCC6803基因组DNA进行PCR扩增，得到spkD基因，所述spkD基因核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

（2）扩增后的spkD片段与pClone007 simple载体连接，然后转化入大肠杆菌DH5α中进行克隆，得到007-spkD质粒；

（3）将007-spkD质粒使用EcoR I内切酶进行酶切，将spkD基因切开，EcoR I内切酶的酶切位点前的spkD基因片段作为同源重组上游臂，酶切位点后的spkD基因片段作为同源重组下游臂；

（4）用EcoR I内切酶酶切质粒pBluescript-Kan，回收卡那霉素片段，与同样经EcoR I内切酶酶切的步骤（3）制得的质粒007-spkD连接，制得质粒007-spkD-kan；

（5）将步骤（4）制得的重组载体007-spkD-kan转化到集胞藻PCC6803，经筛选，制得敲除spkD基因的集胞藻突变株。

4.如权利要求3所述方法I，其特征在于，所述步骤（1）中，spkD基因以集胞藻PCC6803基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得，PCR扩增引物核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

5.如权利要求4所述方法I，其特征在于，所述步骤（1）中，PCR扩增体系如下：

2x M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix 10μL，模板DNA 1μL，引物spkD-F 1μL，引物spkD-R 1μL，ddH₂O 7μL，共计20μL；

PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min，94℃变性25s，60℃复性25s，72℃延伸l min，35个循环后，72℃终延伸5min，4℃保存。

6.权利要求3制备的敲除spkD基因的集胞藻突变株用于调控多不饱和脂肪酸的合成。