[发明专利]一种人多能干细胞高效分化得到内皮祖细胞的方法有效
| 申请号： | 202010156258.6 | 申请日： | 2020-03-09 |
| 公开（公告）号： | CN111440760B | 公开（公告）日： | 2022-09-23 |
| 发明（设计）人： | 杨隽;秦克周;王雍;刘洪宪 | 申请（专利权）人： | 浙江大学 |
| 主分类号： | C12N5/071 | 分类号： | C12N5/071;C12N5/0735;C12N5/10 |
| 代理公司： | 北京东岩跃扬知识产权代理事务所(普通合伙) 11559 | 代理人： | 谷岳 |
| 地址： | 310058 浙江省杭州市杭塘路*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 多能 干细胞 高效 分化 得到 内皮 细胞 方法 | ||
1.一种将人多能干细胞人工分化为内皮祖细胞的方法，其特征在于，当人类的iPSC增长到80％-90％，用Accutase对它们分离并以3×104细胞/孔在玻连蛋白铺底的12孔细胞培养板中进行培养，在补充有25ng/mL肌动蛋白A，10μM Y27632和10ng/mL骨形态发生蛋白4的E8培养基中培养3天，iPSC分化为中胚层内皮细胞；中胚层内皮细胞在补充有100ng/mlFGF2，50ng/mlVEGF，50ng/ml BMP4，5μM SB431542的E6培养基中培养4天，产生EPCs，整个分化过程持续7天；最后制备细胞悬液，进行细胞计数，并准备进行EPCs分离；使用CD31+微球进行EPCs磁珠分选，在含有16％胎牛血清的EGM2培养基中培养；iPSC-EPCs分别用含有终浓度10g/mL的DiI-Ac-LDL的无血清EBM-2培养基中孵育，检测细胞对乙酰化低密度脂蛋白的摄取。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，人类的iPSC用E8培养基传代培养，或用mTeSRTM1完整或成分明确的CDM培养基传代培养，其中，人类的iPSC在维持培养中用EDTA进行消化分离。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，所述Y27632化学结构式如下：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过将10μM的Y27632溶于DMSO后，在分化前三天连续加入分化培养基，得到内皮祖细胞，用含有红色荧光标记乙酰化低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)的无血清EBM-2培养基孵育，通过检测内皮细胞对乙酰化LDL的摄取鉴定内皮细胞功能。
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