[发明专利]稳定表达含有海肾荧光素酶的寨卡病毒复制子的构建方法及其应用

权利要求书

1.稳定表达含有海肾荧光素酶的寨卡病毒复制子的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)CMV-5’UTR-C22片段的克隆：以寨卡病毒ZIKV感染性克隆质粒ZIKVwt-FL为模板，以引物1和引物2为特异性引物，并通过引物设计引入Kpn I限制性酶切位点，PCR扩增寨卡病毒CMV-5’UTR-C22片段；所述引物1和引物2的序列为：

引物1：

5’-GGCGGTACCCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAA-3’；

引物2：

5’-CTTTCGAAGTCATGGCTACTCCGCGTTTTAG-3’；

2)Rluc2a片段的克隆：以Rluc-pGEM T为模板，以引物3和引物4为特异性引物，并通过引物设计引入手足口病的2A切割位点，PCR扩增Rluc2a片段；所述引物3和引物4的序列为：

引物3：

5’-CATAAACTTTCGAAGTCATGGCTACTCCGC-3’；

引物4：

5’-ACGTCTCCCGCAAGCTTGAGAAGGTCAAAATTCAACAGCTGTTGTTCATTTTTGAGAAC-3’；

3)构建CMV-5’UTR-C22-Rluc2a片段：以引物1和引物4为特异性引物，以步骤1)获得的CMV-5’UTR-C22片段和步骤2)获得的Rluc2a片段为模板，通过重叠延伸PCR，连接CMV-5’UTR-C22和Rluc2a序列，构建CMV-5’UTR-C22-Rluc2a片段；

4)E30-NS3片段的克隆：以ZIKVwt-FL为模板，以引物5和引物6为特异性引物，并通过引物设计引入Cla I限制性酶切位点，PCR扩增E30-NS3片段；所述引物5和引物6的序列为：

引物5：

5’-TTCTCAAGCTTGCGGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCATTGGGTCTGAACACAAAG-3’；

引物6：

5’-TGCTTCTTCTTCAGCATCGATGGC-3’；

5)构建CMV-5’UTR-C22-Rluc2a-E30-NS3片段：以引物1和引物6为特异性引物，以步骤3)获得的CMV-5’UTR-C22-Rluc2a片段和步骤4)获得的E30-NS3片段为模板，通过重叠延伸PCR，将CMV-5’UTR-C22-Rluc2a和E30-NS3连接在一起，得CMV-5’UTR-C22-Rluc2a-E30-NS3片段；

6)含有海肾荧光素酶的寨卡病毒复制子Rluc-ZIKV-Rep的构建：将步骤5)获得的CMV-5’UTR-C22-Rluc2a-E30-NS3片段和ZIKVwt-FL，分别用限制性内切酶Kpn I和Cla I双酶切，并用T4 DNA连接酶进行连接，用CMV-5’UTR-C22-Rluc2a-E30-NS3片段替换ZIKVwt-FL的C基因至NS3基因片段，构建含有海肾荧光素酶的寨卡病毒复制子Rluc-ZIKV-Rep。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1)CMV-5’UTR-C22片段的克隆中，PCR反应体系为：ZIKVwt-FL 1ul，引物1和引物2各1ul，KOD buffer 5ul，dNTP 5ul，MgSO₄3ul，KOD 1ul，ddH₂O 33ul，总体系50ul；PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环，最后68℃延伸7min，得CMV-5’UTR-C22片段。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2)Rluc2a片段的克隆中，PCR反应体系为：Rluc-pGEM T 1ul，引物3和引物4各1ul，KOD buffer 5ul，dNTP 5ul，MgSO₄ 3ul，KOD 1ul，ddH₂O 33ul，总体系50ul；PCR反应条件为：95℃预变性5min；98℃10s，58℃30s，68℃1min为一个循环，进行35个循环；最后68℃延伸7min，得Rluc2a片段。