[发明专利]一种三七不定根快速增殖生产三种主要人参皂苷的方法

说明书

本发明提供了一种三七不定根快速增殖及生产三种主要人参皂苷的方法。首先将由三七子叶诱导来的不定根切成约1cm的小段，接种于含有不同浓度的IBA和NAA的1/2SH培养基和不含NH₄NO₃的1/2MS(1/2MS‑N)培养基。分析不定根的诱导及生长情况，确定了最佳培养方式是先将其接种于1/2SH+2.0mg/L IBA+2.0mg/L NAA培养基中，诱导新不定根形成，后转移至1/2MS‑N+2.0mg/L IBA培养基促进不定根伸长，并确定了50g/L的蔗糖为最适浓度。在此基础上，将在1/2SH+2.0mg/L IBA+2.0mg/L NAA培养基中培养3周的不定根接种于装有100mL 1/2MS‑N液体培养基中避光悬浮培养，分析不定根生长及三种人参皂苷(Rg1,Re,Rb1)累积，确定了最佳收获周期为7周；最佳蔗糖浓度为30g/L；最佳IBA浓度为4.0mg/L，最佳初始接种量为3.5g/100mL，此条件下，不定根中皂苷总累积量可达到11.13mg。

技术领域

本发明专利涉及通过快速增殖三七不定根，有效积累三种主要人参皂苷(Rg1、Re、Rb1)的培养方法。本发明属农业生物技术领域。

背景技术

三七(Panax notoginseng)又名田七，金不换等，为五加科人参属植物，与人参亲缘关系很近，且他们的许多活性物质皂苷都是相同的。但在中医用药传统上有显著不同:人参性微温，多作为扶正固表的“气分药”，三七性温，多作为散瘀止血和消肿定痛的“血分药”(占颖等,中国中医药科技,2014,21(6):711-712)。主要原因是三七与人参皂苷类物质含量和种类差别造成的。三七自己特有的成分如：R1、R2、R3、Rf等(张崇喜,博士学位论文,长春:吉林农业大学,2004)。三七中皂苷的含量(6.2～10.32％)远高于人参中的(4.84％)(李向高等,吉林农业大学学报,1984,6(3):95-97)。

世界上野生三七的天然分布区有中国、日本、尼泊尔、缅甸(Baranov,Journal ofethnopharmacology,1982,6:339–353)。天然野生三七几乎已绝迹，适宜栽培区仅集中在中国云南、四川一个狭窄区域。但三七的栽培存在很多问题：生长周期长，且从播种至收获,要经3-5年(王淑琴等,昆明:云南民族出版社,1993)；忌地性强，连作障碍严重；目前栽培区的重金属污染也日益严重(刘源等，江苏农业科学，2018,46(18):298-302)。这些问题都严重制约着三七的产量和品质。

因此利用生物技术手段生产三七细胞、组织等是获取三七各种次级代谢产品的有效途径(郑光植等，植植物学报，1978，20(4):373-375)。三七细胞培养方面，已筛选出三七皂苷含量高的茎愈伤组织无性系(郑光植等,云南植物研究,1989,11:255-262)，且对影响细胞生长及皂苷含量的各种物理化学因素也进行了研究(Zhang等，Journal ofBiotechnology,1996,51(1):49-56；Hong,ProcessBiochemistry,1999,35:491-50；Han等，Enzyme and Microbial Technology，2003，32(4):498-503)。一般而言，与细胞培养相比，不定根中的人参皂苷含量高，且合成要稳定。上海交大的Gao等研究者首先从三七幼嫩花蕾诱导获得了三七不定根(Gao等,Biotech.Letters,2005,27:1771-1775)。而后，他们同一实验室的研究者对影响三七不定根生长的各种因素进行了研究，并确认了三七不定根中含量较高的10种皂苷(淡墨，上海:上海交通大学，2008；Yao等,Appl.Microbiol.Biotechnol.2019，103,4405–4415)。本分明专利的目的是提供一种快速增殖三七不定根，有效积累三种主要人参皂苷(Rg1、Re、Rb1)的培养技术，为利用三七不定根大规模生产三七皂苷奠定前期基础。

发明内容

本发明专利的目的是提供一种快速增殖三七不定根，有效积累三种主要人参皂苷(Rg1、Re、Rb1)的培养技术，具体内容如下：