[发明专利]新型冠状病毒核酸检测微滴式数字PCR试剂盒及其应用

说明书

本发明提供了一种新型冠状病毒核酸检测的微滴式数字PCR试剂盒及其应用，所述试剂盒中反应液含有用于检测COVID‑19 ORF1ab基因及COVID‑19 N基因的引物及探针，以及用于检测人类RNA内参基因的引物及探针，所述探针的两端均标记有荧光基团。本发明充分利用了微流控处理的样品量少，对样品实现快速升降温。系统最高升降温速率可以达到10℃/s，同时，对新型冠状病毒的检测灵敏度比传统qPCR高1‑2个数量级，在低病毒浓度时，检测重复性优于传统qPCR。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒核酸检测的微滴式数字PCR试剂盒及其应用。

背景技术

冠状病毒是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，直径约80-120nm，目前只感染人、鼠、猪、猫、犬、禽类脊椎动物。新型冠状病毒(COVID-19)经确认为新的变种，可引起病毒性肺炎，轻者发热干咳，重者呼吸困难甚至休克。现在市场上广泛用于检测目前流行的新型冠状病毒(COVID-19)的方法是通过核酸抽提纯化然后进行定量PCR的方法。其检测的灵敏度有限，并且容易受到样本中来自病人体内不同化学物质的抑制，从而影响检测的灵敏度。尤其是现在临床上已出现没有症状的人群具有传染性的现象，这对于新型冠状病毒传染的管控带来了很大的不确定性。现急需发展一种灵敏度更高的检测方法来对人群进行筛查。基于上述的数字PCR特点和优势，它是一种很有潜力的检测方法，可以提早发现潜在的感染源。

现有数字PCR的实现一般采用Biorad的数字PCR系统。在他们的系统中，用户将生成的液滴用移液器移至PCR反应试管中，然后将试管放入PCR热循环仪中进行PCR反应，待反应完毕后用户将PCR tube取出放入液滴荧光检测仪中进行液滴荧光的检测。其检测的原理是将液滴和油打入一个毛细管中，液滴单个的通过检测位置，仪器对液滴有无荧光进行读取。这样的系统有以下几个缺点：1)用户在系统产生完液滴后需要进行人工地将液滴转移到96孔板中才能进行下一步PCR反应，这样会造成液滴的损失或者破裂；2)由于传热速率的限制(试管内样品量较厚，加热从试管外侧开始)，PCR在试管中进行反应速度较慢，所以整个PCR过程时间长(150分钟)。

针对目前新型冠状病毒的临床检测的过程中出现的问题：1)出现了临床症状及影像学高度疑似的COVID-19患者，但核酸检测呈阴性；2)部分患者需反复数次检测才能确定核酸检测结果的阴阳性；3)部分经治疗后的患者，体内病毒载量大幅下降，但其体内病毒是否完全清除，是否能够出院？其主要原因有RT-PCR对于低载量病毒检测灵敏度不够，患者采样部位困难，部分病毒RNA在抽提和运输过程中损失等因素。因此一种高灵敏度的COVID-19核酸检测手段迫在眉睫。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种新型冠状病毒核酸检测的微滴式数字PCR试剂盒及其应用。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

新型冠状病毒核酸检测微滴式数字PCR试剂盒，其特征在于：包括有反应液，所述反应液中含有用于检测COVID-19ORF1ab基因及COVID-19N基因的引物及探针，其中，用于检测COVID-19ORF1ab基因的引物及探针包括由SEQ ID NO：1所示的正向引物，由SEQ ID NO：2所示的反向引物及由SEQ ID NO：3所示的探针；所述探针的两端标记有荧光基团；

用于检测COVID-19N基因的引物及探针包括由SEQ ID NO：4所示的正向引物，由SEQ ID NO：5所示的反向引物及由SEQ ID NO：6所示的探针，所述探针的两端标记有荧光基团。

用于检测人类RNA内参基因的引物及探针包括由SEQ ID NO：7所示的正向引物，由SEQ ID NO：8所示的反向引物及由SEQ ID NO：9所示的探针，所述探针的两端标记有荧光基团。

优选地，所述SEQ ID NO：3所示的探针5’端标记有FAM。