[发明专利]坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒及其建立方法

说明书

本发明公开了坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒及其建立方法，包括1000μL的2×premix预混酶，1000μL的超纯水，30μL的DNA Marker DL 2000，30μL的引物lktA‑F，30μL的引物lktA‑R，引物lktA‑F和引物lktA‑R的浓度为10μM，30μL的阴性对照及30μL的阳性对照；通过对PCR反应条件优化，研制出了坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒，通过PCR检测结果与阳性对照和阴性对照比较，证明坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒可以准确快速检测到样品中是否含有坏死杆菌白细胞毒素，并且使用本试剂盒检测具有操作简单，反应灵敏，结果准确的特点。

技术领域

本发明涉一种诊断试剂盒，具体涉及坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒及其建立方法。

背景技术

腐蹄病(Footrot)是由坏死杆菌所导致的能够严重影响动物生产的疾病，作为奶牛三大疾病之一，腐蹄病在我国发病率较高，患该病严重的牛场发病率可达30％-40％，是高度接触性传染病。引发奶牛腐蹄病的因素有很多，当奶牛精饲料比例过高、粗纤维摄入量不足时，导致反刍功能下降，进而引起奶牛瘤胃pH值降低和瘤胃生理机能紊乱，引发瘤胃内的微生物产生过多的内毒素，致使奶牛抵抗力下降；奶牛蹄部在粪污中被泡软时，易导致牛蹄被尖锐物体刺入，以至于在伤口深部产生厌氧环境，厌氧菌在此大量繁殖，菌体产生的毒素会危害机体，导致奶牛腐蹄病。患病奶牛蹄部出现红肿糜烂、软组织增生、脓液流出、组织坏死，并且散发恶臭，严重者出现蹄壳脱落的现象，从而造成体温升高、喜卧、精神沉郁、食欲降低等全身症状，以及支跛、四肢交替负重、疼痛跛行等局部症状，这些症状会致使奶牛生产性能下降，患病严重奶牛会被提前淘汰，造成重大的经济损失。

坏死杆菌(Fusobacterium necrophorum)是革兰氏阴性、专性厌氧多形态杆菌，坏死杆菌包含两个亚种，Fnn和Fnf，Fnn感染家畜为主，而Fnf感染人为主，二者都具有非常强的致病性，均广泛存在于自然界中，在动物口腔、胃肠道等均可分离得到，坏死杆菌属于条件性致病菌，无鞭毛，无芽孢，无荚膜。坏死杆菌生长条件苛刻，需在培养基中添加血液、葡萄糖、肝块或者脑块等营养物质；坏死杆菌常引起皮肤、皮下组织坏死性病变，如腐蹄病、坏死性皮炎、坏死性口炎等；动物机体处于健康状态下，坏死杆菌无法侵入，只有当组织出现蹄部浸软、外伤和微生物感染的前提下，才能在蹄部组织深部大量繁殖；多数情况下坏死杆菌会和节瘤拟杆菌混合侵入奶牛蹄部，此种情况下病情更加严重；坏死杆菌能产生多种毒力因子，白细胞毒素(Leukotoxin)、溶血素、溶胶原蛋白、血凝素、内毒素、血小板凝集素、血小板凝集素；这些毒力因子可以逃避宿主天然免疫屏障，为菌体入侵机体创造条件；其中白细胞毒素是坏死杆菌的主要毒力因子，是细胞外泌的蛋白质；白细胞毒素能对牛羊等反刍兽的白细胞和马的多形核细胞产生毒害作用，而对兔、猪的白细胞没有毒害作用；白细胞毒素对中性粒细胞具有吞噬作用，其释放的产物会对肝细胞造成一定的损伤，能够直接降低肝细胞的防御作用，造成肝实质损伤，从而导致肝脓肿。白细胞毒素可以作为免疫原，在坏死杆菌培养物的上清液中可大量获得，给牛注射培养物的上清液可大大降低牛患腐蹄病概率。

现阶段关于坏死杆菌引起的腐蹄病的PCR检测方法特异性不高，缺少能对临床样品中坏死杆菌毒力基因进行简单、快速、便捷、准确的试剂盒；进行PCR检测后，仍需做进一步的革兰氏染色鉴定，由于感染动物的坏死杆菌白细胞毒素lktA基因十分保守，且坏死杆菌白细胞毒素lktA基因序列具有特异性和很高的同源性；目前坏死杆菌引起的腐蹄病的PCR检测方法特异性不高，缺少能对临床样品中坏死杆菌白细胞毒素毒力基因进行简单、快速、便捷、准确的试剂盒。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明旨在提供坏死杆菌白细胞毒素基因PCR诊断试剂盒及其建立方法，通过对PCR反应条件进行优化，研制出了检测坏死杆菌白细胞毒素基因PCR试剂盒，通过PCR检测结果与阴性对照和阳性对照比较，证明其可以起到快速检测到是否有坏死杆菌白细胞毒素基因的作用，而且具有检测结果准确，具有操作快捷、灵敏，检测方式简单，特异性强，使用效果好的特点。