[发明专利]一种大规模生产黄芪毛状根的方法

权利要求书

1.一种大规模生产黄芪毛状根的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1.制备黄芪无菌苗

将黄芪种子用自来水浸泡20-24h后，放入70％乙醇中浸泡1-3min，用无菌水冲洗3-5遍；倒入1％升汞溶液浸泡8-10min；用无菌水冲洗5-10遍；接种至提前灭菌的MS培养基上，温度25-30℃，湿度50-60％培养，获得黄芪无菌苗；

步骤2.菌种活化和培养

将农杆菌加入到液体YEB培养基中于26-28℃，220-250rpm下培养至OD600值为0.5-0.6；然后，将菌液在1/2MS液体培养基中进行培养，于26-28℃下150-180rpm培养20-30min；

步骤3.材料预培养和共培养

将无菌苗的叶，茎，下胚轴、叶柄转接至添加植物激素的MS培养基上，避光培养1-2天，诱导愈伤组织；然后，再与步骤2中的菌液充分接触，于50-60rpm，25-28℃下共培养30-40min；

步骤4.除菌

将步骤3的愈伤组织加入到含500mg/L的头孢噻肟钠(cef)的1/2MS固体培养基上，于25℃下避光培养；并间隔一周更换新的培养基，同时逐渐降低头孢噻肟钠(cef)的浓度；

待根长度达到3cm后将其分离出来，放于含有50mg/L的头孢噻肟钠(cef)的1/2MS固体培养基上，并间隔一周继代一次，继代三次后，将其放于无头孢噻肟钠(cef)的1/2MS固体培养基上培养；

步骤5.毛状根扩大培养

将步骤4的毛状根转入6,7-V液体培养基中，于25-28℃，100-130rpm下进行扩大培养，并且每18-20天继代一次。

2.根据权利要求1所述的一种大规模生产黄芪毛状根的方法，其特征在于：所述黄芪种子选自蒙古黄芪种子，或膜荚黄芪种子的一种。

3.根据权利要求1所述的一种大规模生产黄芪毛状根的方法，其特征在于：所述MS培养基的每升的组成如下：

大量元素：KNO3 4-6mM，Ca(NO3)2·4H2O 4-6mM，MgSO4·7H2O 1.5-2.5mM，KH2PO40.8-1.2mM，

微量元素：H3BO3 44-48μM，MnCl2·4H2O 8-10μM，ZnSO4·7H2O 0.6-0.8μM，CuSO4·5H2O 0.2-0.4μM，Na2MoO4·2H2O 0.1-0.3μM，EDTA-Fe-Na 40-60μM；

有机物质：肌醇80-100μM，蔗糖100-150μM，水解酪蛋白300-500μM。

4.根据权利要求1所述的一种大规模生产黄芪毛状根的方法，其特征在于：所述1/2MS培养基的组成是将MS培养基中的大量元素的用量减半。

5.根据权利要求1所述的一种大规模生产黄芪毛状根的方法，其特征在于：所述农杆菌菌株选自ATCC15834,LBA9402的一种。

6.根据权利要求1所述的一种大规模生产黄芪毛状根的方法，其特征在于：所述步骤3中的植物激素为IBA、NAA的一种，含量是0.1-0.3mg/L。

7.根据权利要求1所述的一种大规模生产黄芪毛状根的方法，其特征在于：所述液体YEB培养基的制备方法如下：取酵母粉1g,牛肉膏5g,蛋白胨5g,蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g溶于1L蒸馏水，用氢氧化钠调至pH 7.4，于121℃，高压灭菌20min。