[发明专利]GABARAP与OPTN结合在OPTN蓄积导致的神经元病变中的作用

权利要求书

1.一种GABARAP与OPTN结合在OPTN蓄积导致的神经元病变中的作用，其特征在于，包括：

（1）GABARAP 可与OPTN结合形成复合物；

（2）GABARAP与OPTN结合对体内蛋白泛素化降解异常在神经元中的作用；

（3）GABARAP与OPTN结合对对自噬的影响在神经元中的作用。

2.一种GABARAP与OPTN结合在OPTN蓄积导致的神经元病变中的作用的验证方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）GABARAP 可与OPTN 结合形成复合物；

（1-1）构建GST标记的GABARAP、His标记的OPTN的原核表达载体，转化至BL21细菌；IPTG体外诱导三种转化的细菌，体外原核表达上述蛋白，并纯化GST-GAPARAP，将耦合有GST-GAPARAP的Glutathione Sepharose 4B与转化有His-nNOS细菌的裂解液共孵育；洗涤Glutathione Sepharose 4B，SDS 裂解液裂解其携带的蛋白，Western Blot检测上述分子的表达，分析OPTN与GAPARAP 是否存在相互作用；

（1-2）构建HA 标记的GAPARAP 及myc 标记的OPTN 的真核融合表达载体，转化至Top10细菌，抽提质粒；分别将HA-GAPARAP及myc-OPTN 共转染HEK293T细胞，转染后，利用免疫共沉淀，分别检测OPTN 与GAPARAP相结合的情况；

（1-3）利用GABARAP 及OPTN的抗体分别在原代神经元内进行免疫共沉淀，检测两者的相互作用；

（1-4）在此基础上，根据蛋白的结构特征，结合先前的报道及生物信息学软件预测，分别构建OPTN及GABARAP的截短载体，并共转染至HEK293T 细胞，免疫共沉淀联合免疫印迹分析上述分子间结合的结构域；

（1-5）固定HEK293T，分别用HA及Myc特异性的抗体标记外源性OPTN 与GAPARAP的表达，激光共聚焦显微镜分析外源性的OPTN与GABARAP是否存在共定位；

（1-6）固定原代神经元，利用GABARAP及OPTN的抗体及其对应的二抗进行标记，激光共聚焦显微镜分析内源性的OPTN与GAPARAP是否存在共定位；

（2）GABARAP与OPTN结合对蛋白泛素化降解及自噬异常及其在神经元中的作用

（2-1）神经元别感染GABARAP与OPTN的野生型及突变型慢病毒，利用MTT 法检测存活情况、Tunnel 法检测细胞的凋亡、LDH法检测细胞坏死情况、通过JC-10 染料测定细胞线粒体膜电位、通过Tom20标记检测线粒体的变化；

（2-2）在上述神经元中，直接添加UPS抑制剂MG132，利用MTT法检测存活情况、Tunnel法检测细胞的凋亡、LDH法检测细胞坏死情况、通过JC-10染料测定细胞线粒体膜电位改变、通过Tom20标记检测线粒体的变化，同时利用SOD1、TDP-43 及p62的抗体进行免疫共沉淀，检测SOD1、TDP-43及p62 的泛素化影响；

（2-3）分别运用Western blot 法检测细胞LC3B-I/II、ATG-5、p62和Beclin1 的表达水平，并通过荧光显微镜检测LC3B-GFP puncta的水平；运用Co-IP或者激光共聚焦显微镜检测p62-TBK1-OPTN的耦联情况，用电镜检测自噬小体的含量；

（2-4）同时在上述神经元中，分别加入外源性添加自噬不同阶段抑制剂，siRNA敲减自噬活化关键蛋白ATG5或者Beclin-1抑制自噬后，再次利用MTT法检测存活情况、Tunnel法检测细胞的凋亡、LDH法检测细胞坏死情况、通过JC-10染料测定细胞线粒体膜电位改变、通过Tom20标记检测线粒体的变化；

（2-5）综合分析上述结果，明确GABARAP与OPTN结合对神经元功能的影响。

3.根据权利要求2所述的GABARAP与OPTN结合在OPTN蓄积导致的神经元病变中的作用的验证方法，其特征在于，步骤（2-4）中的抑制剂选用3-MA、氯喹、氯化铵。