[发明专利]一种经双侧亲和修饰的拟髓核支架-干细胞组合材料

权利要求书

1.一种经双侧亲和修饰的拟髓核支架-干细胞组合材料，其特征在于，通过以下制备方法获得：

（1）II型胶原/硫酸软骨素生物支架的制备

取II型胶原储存液与硫酸软骨素储存液在冰浴中混合后加入10×磷酸盐缓冲液，以1MNaOH调节pH至7.2，用DMEM高糖培养基定容，获得II型胶原/硫酸软骨素混合液，其中各物质终浓度为：3mg/mL II型胶原, 8.1mg/mL 硫酸软骨素，1×磷酸盐缓冲液，混合液于37℃环境中静置后成胶，将成胶后的II型胶原/硫酸软骨素凝胶于-80℃冷冻干燥过夜获得II型胶原/硫酸软骨素生物支架材料；

（2）经髓核细胞修饰的拟髓核支架的制备

取SD大鼠髓核细胞，体外使用F12培养基扩增至第3代，取4×10^5个髓核细胞使用1mLF12培养基重悬，并接种于II型胶原/硫酸软骨素生物支架中，在特定培养基环境中培养，每3天换一次特定培养基，促进髓核细胞微球中基质产生并沉积至II型胶原/硫酸软骨素生物支架中，培养12天后，联合使用脱细胞剂2%聚乙二醇对异辛基苯基醚和硫代甜菜碱10对支架中的髓核细胞进行脱细胞处理，37℃恒温摇床中以100转/分钟的速率处理1小时，在脱去髓核细胞后利用720mU/mL脱氧核糖核酸酶和720mU/mL核糖核酸酶对残留核酸成分进行灭活，最后使用磷酸盐缓冲液清洗脱细胞后的支架3次，并于-80℃冷冻干燥过夜，从而获得一种经髓核细胞修饰的拟髓核支架；所述特定培养基是在DMEM高糖培养基中添加10ng/mLTGF-β3，10%胎牛血清，50nM维生素C，pH7.0-7.4；

（3）经ManNProp定向编辑的干细胞的制备

提取SD大鼠脂肪来源间充质干细胞，体外使用低糖培养基扩增至第3代，取2×10^5个间充质干细胞接种于6孔板待用，以431.2mg:10mL的甘露糖胺和3mM的丙酰氯为原料，在0℃条件下反应，合成ManNProp初产物，通过硅胶柱层析纯化ManNProp初产物，纯化产物-80℃冻干过夜获得ManNProp粉末，将ManNProp粉末溶解于低糖培养基获得终浓度为0.1 μmol/mL的ManNProp培养基，以ManNProp培养基培养间充质干细胞3天获得经ManNProp定向编辑的干细胞；

（4）经双侧亲和修饰的拟髓核支架-干细胞组合材料的制备

取经髓核细胞修饰的拟髓核支架于ManNProp培养基中充分水合24小时后取出放置于6孔板，取2×10^6个经ManNProp定向编辑的干细胞使用ManNProp培养基重悬，接种至拟髓核支架中，于37℃，5% CO₂环境中贴附2小时，获得经双侧亲和修饰的拟髓核支架-干细胞组合材料。

2.根据权利要求1所述的一种经双侧亲和修饰的拟髓核支架-干细胞组合材料，其特征在于，步骤（1）中DMEM高糖培养基位由4500mg/L D-葡萄糖，584mg/L L-谷氨酰胺，110mg/L丙酮酸钠，1.5g/L碳酸氢钠，100U/mL青霉素，100ug/mL链霉素组成，pH7.0-7.2。

3.根据权利要求1所述的一种经双侧亲和修饰的拟髓核支架-干细胞组合材料，其特征在于，步骤（2）中F12培养基由3151mg/L D-葡萄糖，365mg/L L-谷氨酰胺，55mg/L丙酮酸钠，2438mg/L碳酸氢钠，100U/mL青霉素，100ug/mL链霉素组成，pH7.0-7.4。

4.根据权利要求1所述的一种经双侧亲和修饰的拟髓核支架-干细胞组合材料，其特征在于，步骤（3）中低糖培养基由1000mg/L D-葡萄糖，584mg/L L-谷氨酰胺，110mg/L丙酮酸钠，3700mg/L碳酸氢钠，100U/mL青霉素，100ug/mL链霉素组成，pH7.0-7.4；ManNProp培养基由低糖培养基和0.1μmol/mL ManNProp组成。

5.根据权利要求1所述的一种经双侧亲和修饰的拟髓核支架-干细胞组合材料，其特征在于，步骤（3）中硅胶柱层析洗脱液为乙酸乙酯/甲醇/水=15：2：1。

6.根据权利要求1所述的一种经双侧亲和修饰的拟髓核支架-干细胞组合材料，其特征在于，步骤（3）中ManNProp培养基培养间充质干细胞 3天，需每天更换ManNProp培养基。