[发明专利]一种超临界流体萃取反应制备脱细胞神经移植物的方法

说明书

本发明涉及生物医学工程领域，公开了一种超临界流体萃取反应制备脱细胞神经移植物的方法，包括：切取周围神经，剔除其外脂肪、血管及结缔组织，然后清洗；将清洗后的周围神经浸入表面活性剂溶液中，并置于高温高压反应釜中，通入CO₂排出反应釜内空气，然后进行反应，反应结束后，取出周围神经；然后用十二烷基硫酸钠溶液将周围神经清洗，最后用蒸馏水浸泡。本发明方法大大减少了脱细胞过程中化学试剂的用量和浓度，反应温度低，作用时间短，反应次数少，可有效降低免疫原性，对神经结构破坏很小，不但保持了雪旺细胞基底板层的管状结构完整，神经基底膜管完整、通畅，还保留了在轴突再生中的板层素，具有很好的临床使用效果，值得临床推广。

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，尤其涉及一种超临界流体萃取反应制备脱细胞神经移植物的方法。

背景技术

周围神经缺损是指外伤或手术导致的周围神经干离断，是临床常见病症。神经缺损分为四度，其中Ⅰ、Ⅱ度缺损可以通过改变关节位置或者通过病理方法如游离神经干，前置、改道、延长或缩短骨关节而克服，而Ⅲ度以上(或缺损距离大于缺损神经直径4倍以上)的缺损则必须依靠神经移植或各种代用品桥接才能修复。到目前为止疗效最为确切的神经移植是自体神经移植，就是把患者自身相对不重要的神经移植到缺损部位，目前仍作为评价各种神经移植物效用的“金标准”，但可供移植的神经存在来源有限、组织结构和尺寸难匹配、移植供区长期失神经支配、移植疗效存在差异等不足，这些不足限制了自体神经移植的广泛开展。而同种异体神经移植由于需长期应用免疫抑制剂，移植成功率低，应用也受到限制。但异体(种)神经用作支架材料有其优点：具有神经内膜管结构，还含有能促进神经生长的物质(如层粘连蛋白)，有利于引导和容纳神经轴突生长和通过。去细胞技术的应用拓宽了同种异体神经移植领域的应用，去除异体神经中的活细胞，可以大大减小其抗原性，而基底膜管保存完好，可作为神经组织工程的支架材料。

1998年，瑞典Lund大学的Sondell等应用脱氧胆酸钠和聚乙二醇叔辛基苯基醚(TritonX-100)制备大鼠去细胞神经，不仅清除雪旺细胞等所有细胞成分，还保持了雪旺细胞基底板层的管状结构完整，制备步骤为：(1)蒸馏水中振荡浸浴12h；(2)3％TritonX-100溶液中振荡萃取12h；(3)4％脱氧胆酸钠溶液中振荡萃取24h；(4)视神经直径大小重复上述步骤2-4次；(5)蒸馏水冲洗30min。该方法中所用萃取剂为TritonX-100和脱氧胆酸钠。TritonX-100是一种常用的非离子型的表面活性剂和乳化剂，它被视为一种不变性的相对温和的洗涤剂，经常用于生化应用以溶解蛋白质。他的作用是用于裂解细胞以提取蛋白和细胞器。但其对于粗大和致密的组织，其脱细胞作用不彻底。而脱氧胆酸钠主要作用有：裂解细胞、溶解蛋白，尤其是可以溶解一些难溶于水的蛋白，如膜蛋白等；因此脱氧胆酸钠去细胞彻底，但对神经的结构的破坏也大。另外该方法反应时间长：单次反应一般需要24小时，同时需要3-5次才能够将细胞脱干净。总之，目前普遍采用的化学脱细胞体系存在的缺点：1、化学脱细胞反应液浓度和反应能力强；2、化学脱细胞反应时间太长，反应次数太多；3、由于水体系穿透力差，蛋白质祛除不够彻底，残留值高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种超临界流体萃取反应制备脱细胞神经移植物的方法，本发明方法大大减少了脱细胞化学试剂的用量和浓度，同时所需反应温度低、作用时间短、反应次数少，对神经的结构破坏很小。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种超临界流体萃取反应制备脱细胞神经移植物的方法，包括以下步骤：

1)切取周围神经，剔除所述周围神经的外脂肪、血管及结缔组织后，在蒸馏水中振荡浸浴12h；

2)将步骤1)处理得到的周围神经浸入含有表面活性剂的溶液中，并置于高压反应釜中，通入CO₂排出所述高压反应釜内空气，然后在温度为25～35℃、压力为15～25Mpa的条件下进行反应以去除所述周围神经的蛋白质，反应结束后，打开所述高压反应釜，取出去除蛋白质的周围神经，所述表面活性剂为TritonX-100或TritonX-200；