[发明专利]一种高产洛伐他汀不产桔霉素红色红曲霉菌株的构建方法

说明书

本发明涉及一种高产洛伐他汀不产桔霉素红色红曲霉菌株的构建方法，包括以下步骤：（1）构建ctnR基因敲除质粒pGKO2‑Neo‑up‑ctnR‑dn；（2）构建ctnR基因敲除菌株GN‑01△ctnR；（3）敲除菌株GN‑01△ctnR的验证；（4）构建mokC基因过表达质粒；（5）在基因敲除菌株GN‑01△ctnR中导入mokC基因过表达质粒，获得mokC过表达菌株；（6）mokC过表达菌株的验证。本发明通过代谢产物验证，构建的GN‑01△ctnR基因缺失菌株已不产桔霉素，GN‑01△ctnR‑mokC过表达菌株产Monacolin K的能力较野生菌株提高了30%，达到267 mg/L。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种高产洛伐他汀不产桔霉素红色红曲霉菌株的构建方法。

背景技术

红曲霉属真菌门（Eumycophyta）、子囊菌亚门（Ascomycotina）、不整子囊菌纲（PIectomycetes）、红曲科（Monascaceae），本科仅有一属，即红曲霉属（Monascus）。中国红曲米的生产地主要分布在我国福建、浙江、江苏和台湾等地，由红曲霉在大米等粮食中进行发酵而获得。红曲霉能合成一种天然色素-红曲色素，同时还能合成多种丰富的次级代谢产物，如莫纳可林K（MonacolinK），又叫洛伐他汀，是红曲霉次级代谢产物中有益人体健康的主要功能成分，具有降血脂、降血压和抑制癌细胞增殖等多种功效；然而红曲霉在次级代谢中还可同时分泌高水平的高毒性真菌毒素——桔霉素（Citrinin），该毒素具有很强的肾脏毒性，还能致畸、诱发肿瘤和致突变等，限制了红曲产品的使用，国标对红曲产品中桔霉素含量具有十分严格的限定要求。 因此，获得不产桔霉素和高洛伐他汀产量的红曲霉菌株具有重要的实际应用价值。

红曲霉细胞中桔霉素和洛伐他汀的生物合成均以乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A为起始结构单元，经不同聚酮合成反应代谢路径实现两者的全合成。分子生物学研究发现红曲霉ctnR基因是桔霉素合成基因——聚酮合酶基因（pksCT）的必需转录激活因子，通过同源重组的方法将ctnR基因敲除，可以抑制pksCT基因的转录，从而抑制桔霉素及相关聚酮类化合物的生物合成，实现红曲霉桔霉素的含量的消除。同时，红曲霉菌中的洛伐他汀合成关键基因mokC表达的P450单氧酶能够将4a,5-dihydromonacoline L转化为Monacolin J，是洛伐他汀合成的重要前体物质，通过基因工程方法实现mokC基因在红曲菌株中过表达，可有效提高红曲霉菌洛伐他汀产量。作为聚酮类化合物，桔霉素和洛伐汀他合成的结构前体物质相同，容易导致碳代谢流存在竞争关系，然而目前已报道的论文或公开专利都只是通过单一的基因遗传操作来降低红曲霉菌桔霉素水平或提高其洛伐他汀产量，并未同时在一株红曲霉菌中实现ctnR基因的敲除和mokC基因的过表达，以考察桔霉素和洛伐他汀两者代谢水平的关联变化。本发明通过运用双遗传操作系统，以红色红曲霉菌GN-01为出发菌株，实现红曲霉ctnR基因的敲除及 mokC基因的同步过表达，为高产洛伐他汀的功能红曲产品的生产提供安全高效的红曲菌株。

发明内容

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种提高红色红曲霉洛伐他汀产量且同时不产或低产桔霉素菌株的构建方法。本发明采用的技术方案是：