[发明专利]一种检测猪附红细胞体病的RAA引物、探针及检测方法

权利要求书

1.一种检测猪附红细胞体的RAA荧光法扩增用的引物对，其特征在于，所述的引物对用于扩增序列为SEQ ID NO：1的核酸片段的全部或部分片段。

2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述的引物对包含有序列为SEQ ID NO：3的上游引物和序列为SEQ ID NO：4的下游引物。

3.一种探针，其特征在于，所述的探针用于检测权利要求1或权利要求2所述的引物对的扩增产物。

4.如权利要求3所述的探针，其特征在于，探针序列为SEQ ID NO：6。

5.如权利要求4所述的探针，其特征在于，所述的探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，其中荧光报告基团修饰在探针序列离5′端碱基数30bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3′端碱基数21bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔1个碱基A，其中A用四氢呋喃残基替换。

6.如权利要求5所述的探针，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3。

7.权利要求1或权利要求2所述的引物对和权利要求3～6任一项所述的探针在制备RAA荧光检测试剂盒中的应用。

8.一种RAA荧光检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1或权利要求2所述的引物对和权利要求3～6任一项所述的探针。

9.一种RAA荧光法检测猪附红细胞体的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)提取待检测对象的核酸样品；

2)将恒温荧光基因检测仪接通电源进行预热，对反应参数进行设置；反应参数设置为39℃，反应时间：20min；

3)在25μL反应缓冲液中加入13.7μL水，权利要求1所述的上下游引物和权利要求2～5任一项所述的探针，充分混合后添加到RAA荧光基础反应试剂中混合，得到反应预混液；

4)在反应管盖上加2.5μL的Mg+，将4μL所述步骤1)中得到的核酸样品与所述步骤3)中得到的反应预混液充分混合，得到的反应体系放入恒温荧光基因检测仪检测荧光信号；

5)根据RAA-F1620检测仪器中的阳性判定方法，可以按扩增曲线来判定，有明显扩增曲线，且上游引物和下游引物扩增的曲线相对荧光值大于1500mV判定为阳性，无明显扩增曲线且相对荧光值小于1500mV的判定为阴性。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的上游引物和下游引物的使用浓度为1～50μM；优选为10μM；

所述的探针的浓度为1～50μM；优选为10μM。